Ретроспективное исследование тяжелых респираторных заболеваний для получения информации о наличии COVID-19 (Explore)

A- Методология, принятая в ретроспективном исследовании:

Определение размера выборки:

500 случаев, представленных с ноября 2019 г. по февраль 2020 г., будут включены в исследование больниц университета Айн-Шамс.

Коллекция образцов:

Мазки из ротоглотки и носоглотки (НГ) у госпитализированных больных ТОРИ:

Врачи отделений внутренних болезней, пульмонологических и педиатрических больниц будут нести ответственность за получение мазков из ротоглотки и носоглотки для лабораторных исследований у всех госпитализированных пациентов, которые соответствуют стандартному определению ВОЗ случая ТОРИ.

Мазок из ротоглотки:

Для взятия тампона из задней части глотки следует использовать сухой стерильный наконечник с тампоном из нейлонового волокна. Тампон следует поместить в центрифужную пробирку объемом 15 мл, помеченную уникальным идентификатором пациента и содержащую 2 мл вирусной транспортной среды (VTM). Палочка-аппликатор затем отрезается.

Мазок из носоглотки:

Гибкий стерильный наконечник с тампоном из нейлонового волокна вводят в ноздрю и обратно в носоглотку и оставляют на несколько секунд. Затем его медленно извлекают вращательными движениями. Для пациентов с ТОРИ мазок помещают в ту же центрифужную пробирку, что и мазок из ротоглотки, помеченный уникальным идентификатором пациента, и обрезают стержень. Пробирку объемом 15 мл, содержащую мазок/мазки, следует осторожно доставить в лабораторию больницы как можно скорее в холодовой цепи.

Образец обработки:

Полученные тампоны внутри пробирки объемом 15 мл следует энергично встряхнуть в течение 10 секунд с помощью вихревого миксера, чтобы освободить клетки от кончика тампона, а затем оба тампона следует извлечь из пробирки и выбросить с помощью пинцета. VTM должен быть разделен на 2 предварительно маркированных стерильных криопробирки с правильным идентификатором пациента. Одну криопробирку следует немедленно поместить в морозильную камеру (-70°C), а другую криопробирку использовать для молекулярного тестирования методом ПЦР в реальном времени в MASRI-молекулярной лаборатории.

Образцы будут протестированы с помощью мультиплексной ПЦР в реальном времени с использованием набора FTD-respiratory 33 на наличие широкой панели респираторных патогенов, включая вирусы гриппа A и подтипов гриппа A Pdm(H1N1) и сезонного гриппа H3, гриппа B, гриппа C, парагриппа. 1, 2, 3 и 4; коронавирусы NL63, 229E, OC43 и HKU1; метапневмовирусы человека А и В; риновирус; респираторно-синцитиальные вирусы А и В; аденовирус; энтеровирус; пареховирус; вирус Бока; Пневмоцистис джировеции; Микоплазменная пневмония; хламидии пневмонии; Пневмококк; Haemophilus influenza типа B (анализ HIB также выявляет Haemophilus parahaemolyticus, который связан с фарингитом); золотистый стафилококк; катаральная моракселла; Бордетелла виды. (кроме Bordetella parapertussis), Klebsiella pneumoniae; виды Legionella и виды Salmonella. Случаи с подозрением на MERS-CoV или HPAI H5N1 в соответствии с их историей контактов с птицами или верблюдами или со ссылкой на предполагаемые ВОЗ случаи MERS-CoV или птичьего гриппа будут проверены с использованием протокола CDC.

Пример хранения:

Вторая аликвота образцов будет храниться в морозильных камерах (-70°C) в лаборатории MASRI MOLECULAR для внешнего обеспечения качества (EQA) путем тестирования на месте посредством случайного отбора образцов с разными результатами и повторного тестирования их другими экспертами лаборатории NAMRU-3. в молекулярных лабораториях MASRI; образцы также можно использовать для дальнейшего тестирования с помощью NGS или выделения вируса в молекулярных лабораториях MASRI.

Пример передачи:

Все образцы будут храниться в лабораториях Научно-исследовательского института Айн-Шамса Медицинского факультета и лабораторий Molecular Unit и не будут передаваться в другие лаборатории.

B- Изучить исследование тестирования на COVID-19 с использованием готовых к использованию тест-систем RT-real time. - ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСНОЙ РНК: с использованием имеющихся в продаже наборов, поставляемых thermofisher или другими рекомендованными компаниями. Работа будет проводиться в боксах уровня биобезопасности 2 в условиях полной стерильности. -

ОБНАРУЖЕНИЕ COVID-19:

С помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени ОТ-ПЦР тест можно проводить на образцах из дыхательных путей, полученных различными методами, включая мазок из носоглотки или образец мокроты. Результаты обычно доступны в течение нескольких часов. Молекулярные методы используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), а также тесты на нуклеиновые кислоты и другие передовые аналитические методы для обнаружения генетического материала вируса с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени в диагностических целях. Имеющиеся в продаже наборы, поставляемые компаниями hvd, thermofisher и другими.

C- Секвенирование генома (NGS) для возможных положительных образцов covid-19 Целевое секвенирование следующего поколения (NGS) Ion Torrent обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для полного секвенирования генома и эпидемиологических исследований SARS-CoV-2 (коронавируса, ответственного за COVID-19). ). Благодаря использованию набора высокоспецифичных универсальных праймеров для коронавируса в сочетании с мастер-миксом высокой точности все геномные сегменты амплифицируются, а ампликоны ДНК секвенируются на любой системе Ion Torrent для обеспечения высокоточного типирования коронавируса менее чем за день. Исследовательская группа Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2 состоит из 2 пулов с арнпликонами длиной от 125275 п.н. для полного секвенирования вирусного генома.