Retrospektív tanulmány a súlyos légúti betegségekről a COVID-19 jelenlétének eléréséhez (Explore)

A- A retrospektív tanulmányban elfogadott módszertan:

A minta méretének meghatározása:

A 2019 novembere és 2020 februárja között bemutatott 500 eset szerepel majd az Ain Shams Egyetemi Kórházak felfedező tanulmányában

Mintagyűjtemény:

Oropharyngealis és nasopharyngealis tamponok (NP) kórházi SARI-betegek számára:

A belgyógyászati, mellkasi és gyermekkórházak klinikusai felelősek azért, hogy száj- és orr-garat-tamponokat kapjanak laboratóriumi vizsgálatokhoz minden olyan kórházi betegtől, aki megfelel a WHO szabványos SARI esetmeghatározásának.

Szájüregi tampont:

A hátsó garat törléséhez száraz, steril hegyet kell használni, amelyet nylonszálas tampon applikátorral van ellátva. A tampont egy 15 ml-es centrifugacsőbe kell helyezni, amely a páciens egyedi azonosítójával van ellátva, és amely 2 ml vírusszállító tápközeget (VTM) tartalmaz. Ezután le kell vágni az applikátor rudat.

Nasopharyngealis tampont:

Rugalmas, steril, nylonszálas tampon applikátorral fújt hegyet helyezünk az orrlyukba, majd vissza a nasopharynxbe, és néhány másodpercig a helyén hagyjuk. Ezután lassan, forgó mozdulattal visszahúzzuk. SARI-betegeknél a tampont ugyanabba a centrifugacsőbe helyezik, mint a páciens egyedi azonosítójával ellátott oropharyngeális tampont, és levágják a szárat. A tampont/tamponokat tartalmazó 15 ml-es csövet a lehető leghamarabb hidegláncban kell óvatosan a kórházi laboratóriumba szállítani.

Mintafeldolgozás:

A 15 ml-es csőben kapott tamponokat 10 másodpercig erőteljesen keverni kell vortex keverővel, hogy a sejteket a tampont hegyéről eltávolítsák, majd mindkét tampont ki kell venni a csőből, és csipesszel el kell dobni. A VTM-et 2 előre felcímkézett, steril krioviálra kell felosztani a megfelelő betegazonosítóval. Az egyik mélyhűtőt azonnal fagyasztóba kell helyezni (-70°C), míg a másik krioviálist a MASRI molekuláris laboratóriumában valós idejű PCR-rel végzett molekuláris vizsgálatra használjuk.

A mintákat valós idejű multiplex PCR-rel tesztelik FTD-respirációs 33 készlettel a légúti kórokozók széles csoportjának jelenlétére, amelyek közé tartozik: influenza A és influenza A altípusai Pdm(H1N1) és szezonális H3, influenza B, influenza C, parainfluenza vírusok. 1., 2., 3. és 4.; az NL63, 229E, OC43 és HKU1 koronavírusok; humán metapneumovírus A és B; rhinovírus; légúti syncytialis A és B vírusok; adenovírus; enterovírus; parechovírus; Boca vírus; Pneumocystis jirovecii; Mycoplasma pneumoniae; Chlamydia pneumoniae; Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenza B típusú (HIB vizsgálat a Haemophilus parahaemolyticust is kimutatja, amely torokgyulladással társul); Staphylococcus aureus; Moraxella catarrhalis; Bordetella spp. (kivéve Bordetella parapertussis), Klebsiella pneumoniae; Legionella fajok és Salmonella fajok. A MERS-CoV-val vagy a HPAI H5N1-re gyanítható eseteket a madarakkal vagy tevével való érintkezésük előzményei alapján, vagy a WHO által feltételezett MERS-CoV- vagy madárinfluenza-esetekre való hivatkozással a CDC protokoll segítségével tesztelik.

Mintatárolás:

A minták második alikvot részét a MASRI MOLECULAR Külső Minőségbiztosítási Laboratóriumában (EQA) fagyasztószekrényekben (-70°C) tárolják, helyszíni teszteléssel, véletlenszerű minták kiválasztásával, különböző eredményekkel, és más NAMRU-3 laboratóriumi szakértővel újra tesztelik őket. a MASRI molekuláris laborokban; a minták további NGS-vizsgálatokhoz vagy vírusizolációhoz is felhasználhatók a MASRI molekuláris laboratóriumaiban.

Mintaátvitel:

Minden mintát az Orvostudományi Kar Ain Shams Kutatóintézet Molekuláris Egység laboratóriumaiban őriznek, és nem szállítják át más laboratóriumokba.

B- Fedezze fel a COVID-19-re vonatkozó vizsgálati teszteket a használatra kész, valós idejű RT tesztvizsgálatok segítségével – VÍRUS-RNS IZOLÁLÁS: A thermofisher vagy más ajánlott cégek által szállított, kereskedelmi forgalomban kapható készletek felhasználásával. A munka Biosafety 2. szintű szekrényekben, teljesen steril körülmények között történik. -

COVID-19 ÉSZLELÉS:

A valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakciós RT-PCR segítségével a tesztet különböző módszerekkel nyert légúti mintákon lehet elvégezni, beleértve a nasopharyngealis tampont vagy a köpetmintát. Az eredmények általában néhány órán belül elérhetők. A molekuláris módszerek a polimeráz láncreakciót (PCR), nukleinsavtesztekkel és más fejlett analitikai technikákkal együtt alkalmazzák a vírus genetikai anyagának kimutatására, valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakciót használva diagnosztikai célokra. Kereskedelmi forgalomban kapható készletek, amelyeket a hvd, thermofisher és mások szállítanak.

C-Genome szekvenálás (NGS) az esetleges pozitív covid-19 mintákhoz Az Ion Torrent célzott következő generációs szekvenálás (NGS) egyszerűsített kutatási munkafolyamatot tesz lehetővé a SARS-CoV-2 (a COVID-19-ért felelős koronavírus) teljes genomszekvenálása és epidemiológiai vizsgálata érdekében ). A rendkívül specifikus, univerzális koronavírus-primerek és a nagy pontosságú mesterkeverék együttes használata révén az összes genomiális szegmens amplifikálódik, és a DNS-amplikonokat bármely Ion Torrent rendszeren megszekvenálják, hogy rendkívül pontos koronavírus-tipizálást biztosítsanak egy nap alatt. Az Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel 2 poolból áll, amelyek arnpliconjai 125 275 bp iri hosszúságúak a teljes vírusgenom szekvenáláshoz