Takautuva tutkimus vakavista hengitystiesairauksista COVID-19:n läsnäolon löytämiseksi (Explore)

A- Retrospektiivisessä tutkimuksessa käytetty metodologia:

Näytteen koon määritys:

500 tapausta, jotka esiteltiin marraskuusta 2019 helmikuuhun 2020, sisällytetään Ain shamsin yliopistosairaaloiden tutkimustutkimukseen

Näytteiden kokoelma:

Suunielun ja nenänielun vanupuikko (NP) sairaalahoidossa oleville SARI-potilaille:

Sisätautien, rintakehän ja lasten sairaaloiden kliinikot ovat vastuussa suunielun ja nenänielun pyyhkäisynäytteiden hankkimisesta laboratoriotutkimuksia varten kaikilta sairaalassa olevilta potilailta, jotka täyttävät WHO:n standardin SARI-tapausmäärittelyn.

Suunielun vanupuikko:

Takanielun pyyhkimiseen tulee käyttää kuivaa steriiliä kärkeä, jossa on nylonkuitupuikkoapplikaattori. Vanupuikko tulee laittaa 15 ml:n sentrifugiputkeen, jossa on potilaan yksilöllinen tunnus ja joka sisältää 2 ml viraalista kuljetusalustaa (VTM). Tämän jälkeen applikaattoritikku leikataan pois.

Nenänielun vanupuikko:

Joustava, steriili kärki, jossa on nylonkuitupuikkoapplikaattori, työnnetään sieraimeen ja takaisin nenänieluun ja jätetään paikalleen muutamaksi sekunniksi. Sitten se vedetään hitaasti pois pyörivällä liikkeellä. SARI-potilailla vanupuikko laitetaan samaan sentrifugiputkeen kuin potilaan yksilöllisellä tunnisteella merkitty suunielun vanupuikko ja varsi leikataan. Pyyhkäisynäytteen sisältävä 15 ml:n putki tulee kuljettaa huolellisesti sairaalan laboratorioon kylmäketjussa mahdollisimman pian.

Näytteen käsittely:

15 ml:n putkessa vastaanotettuja vanupuikkoja tulee ravistella voimakkaasti 10 sekunnin ajan pyörresekoittimella solujen vapauttamiseksi vanupuikkokärjestä, minkä jälkeen molemmat vanupuikot tulee poistaa putkesta ja heittää pois pihdeillä. VTM tulee jakaa kahteen valmiiksi merkittyyn, steriiliin kryoviaaliin, joissa on oikea potilastunnus. Yksi kryovial tulee laittaa välittömästi pakastimeen (-70°C), kun taas toista kryovialia käytetään molekyylitestaukseen reaaliaikaisella PCR:llä MASRI-molekyylilaboratoriossa.

Näytteet testataan reaaliaikaisella multiplex-PCR:llä käyttäen FTD-respirator 33 -sarjaa laajan paneelin hengitysteiden patogeenien esiintymiseksi, mukaan lukien: influenssa A ja alatyypit influenssa A Pdm(H1N1) ja kausiluonteinen H3, influenssa B, influenssa C, parainfluenssavirukset. 1, 2, 3 ja 4; koronavirukset NL63, 229E, OC43 ja HKU1; ihmisen metapneumovirukset A ja B; rinovirus; hengitysteiden synsyyttivirukset A ja B; adenovirus; enterovirus; parekovirus; Boca-virus; Pneumocystis jirovecii; Mycoplasma pneumoniae; Chlamydia pneumoniae; Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenza tyyppi B (HIB-määritys havaitsee myös Haemophilus parahaemolyticuksen, joka liittyy nielutulehdukseen); Staphylococcus aureus; Moraxella catarrhalis; Bordetella spp. (paitsi Bordetella parapertussis), Klebsiella pneumoniae; Legionellalajit ja salmonellalajit. Tapaukset, joilla epäillään MERS-CoV- tai HPAI H5N1 -tartuntaa lintujen tai kamelien kanssa kosketusten historian tai WHO:n epäiltyjen MERS-CoV- tai lintuinfluenssatapausten perusteella, testataan CDC-protokollaa käyttäen.

Näytteen tallennus:

Toinen näytteiden alikvootti säilytetään pakastimissa (-70 °C) MASRI MOLECULAR -laboratoriossa ulkoisen laadunvarmistuksen (EQA) laboratoriossa testaamalla paikan päällä satunnaisvalinnan avulla eri tuloksilla saatuja näytteitä ja testaamalla ne uudelleen muun NAMRU-3-laboratorion asiantuntemuksella. MASRI-molekyylilaboratorioissa; näytteitä voidaan käyttää myös lisätestaukseen NGS:llä tai viruseristyksellä MASRI:n molekyylilaboratorioissa.

Esimerkkisiirto:

Kaikki näytteet säilytetään lääketieteellisen tiedekunnan Ain Shams Research Institute-Molecular Unit -laboratorioissa, eikä niitä siirretä muihin laboratorioihin.

B- Tutustu COVID-19:n tutkimustesteihin käyttämällä käyttövalmiita reaaliaikaisia ​​RT-testimäärityksiä - VIRUS-RNA:N ERISTÄMINEN: käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevia thermofisherin tai muiden suosittelemien yritysten toimittamia sarjoja. Työt tehdään Biosafety level 2 -kaapeissa täysin steriileissä olosuhteissa. -

COVID-19-TUNNISTUS:

Reaaliaikaisella käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktion RT-PCR:llä testi voidaan tehdä eri menetelmillä otetuille hengitysnäytteille, mukaan lukien nenänielun vanupuikko tai yskösnäyte. Tulokset ovat yleensä saatavilla muutamassa tunnissa. Molekyylimenetelmät hyödyntävät polymeraasiketjureaktiota (PCR) yhdessä nukleiinihappotestien ja muiden kehittyneiden analyyttisten tekniikoiden kanssa viruksen geneettisen materiaalin havaitsemiseksi käyttämällä reaaliaikaista käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktiota diagnostisiin tarkoituksiin. Kaupallisesti saatavilla olevat sarjat, joita toimittaa hvd, thermofisher ja muut.

C-Genomisekvensointi (NGS) mahdollisille positiivisille covid-19-näytteille Ion Torrent -kohdennettu seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) mahdollistaa virtaviivaistetun tutkimustyön kulun SARS-CoV-2:n (COVID-19:stä vastuussa olevan koronaviruksen) täydelliseen genomin sekvensointiin ja epidemiologisiin tutkimuksiin. ). Käyttämällä sarjaa erittäin spesifisiä, universaaleja koronavirusalukkeita yhdessä high-fidelity master -seoksen kanssa, kaikki genomiset segmentit monistetaan ja DNA-amplikonit sekvensoidaan missä tahansa Ion Torrent -järjestelmässä erittäin tarkan koronaviruksen tyypityksen aikaansaamiseksi alle vuorokaudessa. Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2 -tutkimuspaneeli koostuu kahdesta poolista, joissa on 125 275 bp:n arnplikoneja, joiden pituus on 125 275 bp:n iripituus täydellistä virusgenomin sekvensointia varten.