COVID-19의 존재에 접근하기 위한 중증 호흡기 질환에 대한 후향적 연구 (Explore)

A- 후향적 연구에서 채택된 방법론:

샘플 크기 결정:

2019년 11월부터 2020년 2월까지 제출된 500건의 증례는 Ain shams 대학 병원의 탐색 연구에 포함될 예정입니다.

샘플 수집:

입원한 SARI 환자를 위한 구인두 및 비인두 면봉(NP):

내과, 흉부 및 소아과 병원의 임상의는 WHO 표준 SARI 사례 정의를 충족하는 모든 입원 환자로부터 실험실 테스트를 위해 구인두 및 비인두 면봉을 확보할 책임이 있습니다.

구인두 면봉 채취:

나일론 섬유 면봉 어플리케이터로 묶인 건조 멸균 팁을 사용하여 후인두를 면봉으로 닦아야 합니다. 면봉은 환자 고유 ID가 표시된 15ML 원심분리기 튜브에 넣고 2mL 바이러스 수송 배지(VTM)를 포함해야 합니다. 그런 다음 어플리케이터 스틱이 잘립니다.

비인두 면봉 채취:

나일론 섬유 면봉 어플리케이터로 묶인 유연하고 멸균된 팁을 콧구멍에 삽입하고 비인두로 다시 삽입하고 몇 초 동안 제자리에 둡니다. 그런 다음 회전 동작으로 천천히 빼냅니다. SARI 환자의 경우 면봉을 환자의 고유 ID가 표시된 구인두 면봉과 ​​동일한 원심분리기 튜브에 넣고 샤프트를 절단합니다. 면봉이 들어 있는 15ml 튜브는 콜드 체인에서 가능한 한 빨리 병원 실험실로 조심스럽게 운반해야 합니다.

샘플 처리:

15 ml 튜브 내부에 수용된 스왑은 10초 동안 보텍스 믹서를 사용하여 격렬하게 교반하여 스왑 팁에서 세포를 제거한 다음 두 스왑을 튜브에서 제거하고 겸자를 사용하여 폐기해야 합니다. VTM은 올바른 환자 ID가 있는 2개의 사전 라벨이 부착된 멸균 냉동 바이알로 분할되어야 합니다. 하나의 cryovial은 즉시 냉동고(-70°C)에 넣어야 하며, 다른 cryovial은 MASRI 분자 실험실에서 실시간 PCR에 의한 분자 테스트에 사용됩니다.

샘플은 인플루엔자 A 및 아형 인플루엔자 A Pdm(H1N1) 및 계절성 H3, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 파라인플루엔자 바이러스를 포함하는 광범위한 호흡기 병원체 패널의 존재에 대해 FTD-호흡기 33 키트를 사용하여 실시간 다중 PCR로 테스트됩니다. 1, 2, 3 및 4; 코로나바이러스 NL63, 229E, OC43 및 HKU1; 인간 메타뉴모바이러스 A 및 B; 리노바이러스; 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 B; 아데노바이러스; 엔테로바이러스; 파레코바이러스; 보카 바이러스; 뉴모시스티스 지로베시이(Pneumocystis jirovecii); 마이코플라즈마 뉴모니아에; 클라미디아 뉴모니아에; 연쇄상 구균에 의한 폐렴; B형 헤모필루스 인플루엔자(HIB 분석은 또한 인두염과 관련된 헤모필루스 파라헤몰리티쿠스를 검출함); 황색포도상구균; 모락셀라 카타랄리스; 보르데텔라 종 (Bordetella parapertussis 제외), Klebsiella pneumoniae; 레지오넬라 종 및 살모넬라 종. 새나 낙타와의 접촉 이력에 따라 MERS-CoV 또는 HPAI H5N1로 의심되는 사례 또는 MERS-CoV 또는 조류 인플루엔자의 WHO 의심 사례를 참조하여 CDC 프로토콜을 사용하여 테스트합니다.

샘플 보관:

샘플의 두 번째 분취량은 외부 품질 보증(EQA)을 위해 MASRI MOLECULAR 실험실의 냉동고(-70°C)에 다른 결과가 있는 샘플을 무작위로 선택하여 현장 테스트를 통해 저장하고 다른 NAMRU-3 실험실 전문가가 다시 테스트합니다. MASRI 분자 실험실에서; 샘플은 MASRI 분자 실험실에서 NGS 또는 바이러스 분리에 의한 추가 테스트에도 사용할 수 있습니다.

샘플 전송:

모든 샘플은 의과대학 아인샴스 연구소-분자단위 연구실에 보관되며 다른 연구실로 이전되지 않습니다.

B- 바로 사용할 수 있는 RT 실시간 테스트 분석을 사용하여 COVID-19에 대한 연구 테스트 탐색 - 바이러스 RNA 분리: thermofisher 또는 기타 권장 회사에서 제공하는 시판 키트 사용. 작업은 완전한 무균 상태에서 생물안전 레벨 2 캐비닛에서 수행됩니다. -

COVID-19 감지:

실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응 RT-PCR을 이용하여 비인두 면봉 또는 객담 검체를 포함하여 다양한 방법으로 얻은 호흡기 검체에 대해 검사를 수행할 수 있습니다. 결과는 일반적으로 몇 시간 내에 제공됩니다. 분자적 방법은 핵산 검사 및 기타 고급 분석 기술과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 활용하여 진단 목적으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 사용하여 바이러스의 유전 물질을 검출합니다. hvd, thermofisher 등에서 제공하는 상용 키트.

가능한 양성 covid-19 샘플에 대한 C- 게놈 시퀀싱(NGS) Ion Torrent 표적 차세대 시퀀싱(NGS)은 SARS-CoV-2(COVID-19를 유발하는 코로나바이러스 ). 고충실도 마스터 믹스와 함께 매우 특이적이고 보편적인 코로나바이러스 프라이머 세트를 사용하여 모든 게놈 세그먼트가 증폭되고 DNA 앰플리콘이 Ion Torrent 시스템에서 시퀀싱되어 매우 정확한 코로나바이러스 타이핑을 하루 안에 제공합니다. Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2 연구 패널은 완전한 바이러스 게놈 시퀀싱을 위해 125275 bp iri 길이 범위의 arnplicon이 포함된 2개의 풀로 구성됩니다.