Retrospektiv undersøgelse af alvorlig luftvejssygdom for at få adgang til tilstedeværelsen af ​​COVID-19 (Explore)

A- Metode anvendt i den retrospektive undersøgelse:

Prøvestørrelsesbestemmelse:

500 tilfælde præsenteret fra november 2019- februar 2020 vil blive inkluderet i udforske undersøgelse fra Ain shams universitetshospitaler

Samling af prøver:

Orofaryngeale og nasopharyngeale podninger (NP) til indlagte SARI-patienter:

Klinikere på internmedicinske, bryst- og pædiatriske hospitaler vil være ansvarlige for at få mundhule- og nasopharyngeale podninger til laboratorieundersøgelser fra alle indlagte patienter, som opfylder WHO's standard SARI-tilfældedefinition.

Orofaryngeal podning:

En tør steril spids flokket med en nylonfiberpodningsapplikator skal bruges til at pode den bageste svælg. Podepinden skal placeres i et 15 ML centrifugerør mærket med patientens unikke ID og indeholdende 2mL viralt transportmedium (VTM). Applikatorpinden skæres derefter af.

Nasopharyngeal podning:

En fleksibel, steril spids flocket med nylonfiber vatpindsapplikator indsættes i næseboret og tilbage til nasopharynx og efterlades på plads i nogle få sekunder. Den trækkes derefter langsomt tilbage med en roterende bevægelse. For SARI-patienter placeres podepinden i samme centrifugerør som den orofaryngeale podepind mærket med patientens unikke ID, og ​​skaftet skæres over. 15 ml-røret, der indeholder podepinden/-pindene, skal omhyggeligt transporteres til hospitalslaboratoriet så hurtigt som muligt i kølekæde.

Prøvebehandling:

De modtagne podninger inde i 15 ml-røret skal omrøres kraftigt i 10 sekunder ved hjælp af en vortex-mixer for at frigøre celler fra podepinden, og derefter skal begge podepinde fjernes fra røret og kasseres med en pincet. VTM'en skal opdeles i 2 præ-mærkede, sterile kryoglas med det korrekte patient-id. Det ene kryovial skal straks placeres i en fryser (-70°C), mens det andet kryovial vil blive brugt til molekylær testning ved real-time PCR på MASRI-molekylært laboratorium.

Prøver vil blive testet ved realtids multiplex PCR ved hjælp af FTD-respiratory 33 kit for tilstedeværelsen af ​​et bredt panel af respiratoriske patogener, der inkluderer: influenza A og subtype influenza A Pdm(H1N1) og sæsonbestemt H3, influenza B, influenza C, parainfluenzavirus 1, 2, 3 og 4; coronavirus NL63, 229E, OC43 og HKU1; humane metapneumovira A og B; rhinovirus; respiratoriske syncytiale vira A og B; adenovirus; enterovirus; parechovirus; Boca virus; Pneumocystis jirovecii; Mycoplasma pneumoniae; Chlamydia pneumoniae; Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenza type B (HIB-assay detekterer også Haemophilus parahaemolyticus, som er forbundet med pharyngitis); Staphylococcus aureus; Moraxella catarrhalis; Bordetella spp. (undtagen Bordetella parapertussis), Klebsiella pneumoniae; Legionella-arter og Salmonella-arter. Tilfælde med mistanke om MERS-CoV eller HPAI H5N1 i henhold til deres historie med kontakt med fugle eller kameler eller med henvisning til WHO mistænkte tilfælde af MERS-CoV eller fugleinfluenza vil blive testet ved hjælp af CDC-protokollen.

Eksempel på opbevaring:

Den anden aliquot af prøverne vil blive opbevaret i frysere (-70°C) på MASRI MOLECULAR laboratorium for ekstern kvalitetssikring (EQA) ved på stedet testning gennem tilfældig udvælgelse af prøver med forskellige resultater og gentest dem af anden NAMRU-3 laboratorieekspertise i MASRI molekylære laboratorier; prøverne kan også bruges til yderligere test ved NGS eller virusisolering i MASRI molekylære laboratorier.

Prøveoverførsel:

Alle prøver vil blive opbevaret i Det Medicinske Fakultet Ain Shams Research Institute- Molecular Unit laboratorier og vil ikke blive overført til andre laboratorier.

B- Udforsk undersøgelsestest for COVID-19 ved brug af brugsklare RT-realtidstestanalyser - VIRAL RNA ISOLERING: Brug af kommercielt tilgængelige kits leveret af thermofisher eller andre anbefalede virksomheder. Arbejdet vil blive udført i Biosafety niveau 2 kabinetter under fuldstændig sterile forhold. -

COVID-19 DETEKTION:

Ved hjælp af real-time revers transkription polymerase kædereaktion RT-PCR kan testen udføres på respiratoriske prøver opnået ved forskellige metoder, herunder nasopharyngeal podning eller sputumprøve. Resultaterne er generelt tilgængelige inden for et par timer. Molekylære metoder udnytter polymerasekædereaktion (PCR) sammen med nukleinsyretests og andre avancerede analytiske teknikker til at detektere virusets genetiske materiale ved hjælp af real-time revers transkription polymerase kædereaktion til diagnostiske formål. Kommercielt tilgængelige sæt leveret af hvd, thermofisher og andre.

C- Genom-sekventering (NGS) for mulige positive covid-19-prøver Ion Torrent-målrettet næste generations sekventering (NGS) muliggør en strømlinet forsknings-workflow for komplet genom-sekventering og epidemiologiske undersøgelser af SARS-CoV-2 (coronaviruset, der er ansvarlig for COVID-19) ). Gennem brugen af ​​et sæt meget specifikke, universelle coronavirus-primere i kombination med en high-fidelity mastermix, amplificeres alle genomiske segmenter, og DNA-amplikonerne sekventeres på ethvert Ion Torrent-system for at levere meget nøjagtig coronavirus-typning på under en dag. Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2-forskningspanelet består af 2 puljer med arnplikoner, der spænder fra 125275 bp iri-længde til komplet viral genomsekventering