Estudo retrospectivo sobre doenças respiratórias graves para acessar a presença do COVID-19 (Explore)

A- Metodologia adotada no estudo retrospectivo:

Determinação do Tamanho da Amostra:

500 casos apresentados de novembro de 2019 a fevereiro de 2020 serão incluídos no estudo de exploração dos hospitais universitários de Ain Shams

Coleta de Amostras:

Swabs orofaríngeos e nasofaríngeos (NP) para pacientes hospitalizados com SARI:

Os médicos dos hospitais de medicina interna, tórax e pediatria serão responsáveis ​​pela obtenção de swabs orofaríngeos e nasofaríngeos para testes laboratoriais de todos os pacientes hospitalizados que atendem à definição de caso SARI padrão da OMS.

Swab orofaríngeo:

Uma ponta estéril seca com aplicador de swab de fibra de nylon deve ser usada para esfregar a faringe posterior. O swab deve ser colocado em um tubo de centrífuga de 15 ML rotulado com a ID exclusiva do paciente e contendo 2mL de meio de transporte viral (VTM). O bastão aplicador é então cortado.

Swab nasofaríngeo:

Uma ponta flexível e estéril revestida com aplicador de swab de fibra de náilon é inserida na narina e de volta à nasofaringe e deixada no local por alguns segundos. Em seguida, é lentamente retirado com um movimento de rotação. Para pacientes com SARI, o swab é colocado no mesmo tubo de centrífuga que o swab orofaríngeo rotulado com a identificação exclusiva do paciente e o eixo é cortado. O tubo de 15 ml contendo a(s) zaragatoa(s) deve ser cuidadosamente transportado para o laboratório do hospital o mais rapidamente possível em cadeia de frio.

Processamento de amostras:

Os swabs recebidos dentro do tubo de 15 ml devem ser agitados vigorosamente por 10 segundos usando um misturador de vórtice para liberar as células da ponta do swab e, em seguida, os dois swabs devem ser removidos do tubo e descartados com uma pinça. O VTM deve ser dividido em 2 criotubos estéreis pré-etiquetados com a identificação correta do paciente. Um criotubo deve ser imediatamente colocado em um freezer (-70°C), enquanto o outro criotubo será utilizado para teste molecular por PCR em tempo real no laboratório MASRI-molecular.

As amostras serão testadas por PCR multiplex em tempo real usando o kit FTD-respiratory 33 para a presença de um amplo painel de patógenos respiratórios que incluem: influenza A e subtipos influenza A Pdm(H1N1) e sazonal H3, influenza B, influenza C, vírus parainfluenza 1, 2, 3 e 4; coronavírus NL63, 229E, OC43 e HKU1; metapneumovírus humanos A e B; rinovírus; vírus sinciciais respiratórios A e B; adenovírus; enterovírus; parechovírus; Boca vírus; Pneumocystis jirovecii; Mycoplasma pneumoniae; Chlamydia pneumoniae; Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenza tipo B (o ensaio de HIB também detecta Haemophilus parahaemolyticus que está associado a faringite); Staphylococcus aureus; Moraxella catarrhalis; Bordetella spp. (exceto Bordetella parapertussis), Klebsiella pneumoniae; Espécies de Legionella e espécies de Salmonella. Casos suspeitos de MERS-CoV ou HPAI H5N1 de acordo com seu histórico de contato com aves ou camelos ou com referência a casos suspeitos de MERS-CoV ou influenza aviária da OMS serão testados usando o protocolo do CDC.

Armazenamento de amostras:

A segunda alíquota das amostras será armazenada em freezers (-70°C) no laboratório MASRI MOLECULAR para Garantia de Qualidade Externa (EQA) por meio de teste no local por meio de seleção aleatória de amostras com resultados diferentes e reteste-as por outros especialistas do laboratório NAMRU-3 nos laboratórios moleculares MASRI; as amostras também podem ser usadas para testes adicionais por NGS ou isolamento de vírus em laboratórios moleculares MASRI.

Transferência de amostra:

Todas as amostras serão mantidas nos laboratórios da Unidade Molecular do Instituto de Pesquisa Ain Shams da Faculdade de Medicina e não serão transferidas para outros laboratórios.

B- Explore o teste de estudo para COVID-19 usando ensaios de teste RT em tempo real prontos para usar - ISOLAMENTO DE RNA VIRAL: usando kits disponíveis comercialmente fornecidos pela thermofisher ou outras empresas recomendadas. O trabalho será feito em gabinetes de nível de biossegurança 2 em condições totalmente estéreis. -

DETECÇÃO DE COVID-19:

Usando RT-PCR de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real, o teste pode ser feito em amostras respiratórias obtidas por vários métodos, incluindo swab nasofaríngeo ou amostra de escarro. Os resultados geralmente ficam disponíveis em algumas horas. Os métodos moleculares utilizam a reação em cadeia da polimerase (PCR), juntamente com testes de ácido nucleico e outras técnicas analíticas avançadas, para detectar o material genético do vírus usando a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real para fins de diagnóstico. Kits disponíveis comercialmente fornecidos pela hvd, thermofisher e outros.

C- Sequenciamento do genoma (NGS) para possíveis amostras positivas de covid-19 O sequenciamento de próxima geração (NGS) direcionado pelo Ion Torrent permite um fluxo de trabalho de pesquisa simplificado para o sequenciamento completo do genoma e estudos epidemiológicos do SARS-CoV-2 (o coronavírus responsável pelo COVID-19 ). Através do uso de um conjunto de primers de coronavírus universais altamente específicos em combinação com um master mix de alta fidelidade, todos os segmentos genômicos são amplificados e os amplicons de DNA são sequenciados em qualquer sistema Ion Torrent para fornecer uma tipagem de coronavírus altamente precisa em menos de um dia. O Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel consiste em 2 pools com arnplicons variando de 125275 pb de comprimento iri para sequenciamento completo do genoma viral