Retrospektive Studie zu schweren Atemwegserkrankungen, um das Vorhandensein von COVID-19 festzustellen (Explore)

A- Methodik der retrospektiven Studie:

Bestimmung der Stichprobengröße:

500 Fälle, die zwischen November 2019 und Februar 2020 vorgestellt wurden, werden in die Untersuchungsstudie der Universitätskliniken von Ain Shams einbezogen

Sammlung von Proben:

Oropharyngeale und nasopharyngeale Abstriche (NP) für hospitalisierte SARI-Patienten:

Ärzte in den Krankenhäusern für Innere Medizin, Thoraxchirurgie und Kinderkrankenhäuser sind dafür verantwortlich, oropharyngeale und nasopharyngeale Abstriche für Labortests von allen hospitalisierten Patienten zu entnehmen, die der WHO-Standard-SARI-Falldefinition entsprechen.

Oropharyngealer Abstrich:

Zum Abtupfen des hinteren Rachenraums sollte eine trockene, sterile Spitze mit Nylonfaser-Tupferapplikator verwendet werden. Der Tupfer sollte in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben werden, das mit der eindeutigen Patienten-ID gekennzeichnet ist und 2 ml Virustransportmedium (VTM) enthält. Anschließend wird das Applikatorstäbchen abgeschnitten.

Nasopharynxabstrich:

Ein flexibler, steriler, mit Nylonfasern beflockter Tupferapplikator wird in das Nasenloch und zurück zum Nasopharynx eingeführt und dort einige Sekunden lang belassen. Anschließend wird es langsam mit einer Drehbewegung herausgezogen. Bei SARI-Patienten wird der Abstrichtupfer in dasselbe Zentrifugenröhrchen wie der oropharyngeale Abstrichtupfer gegeben, der mit der eindeutigen ID des Patienten versehen ist, und der Schaft wird abgeschnitten. Das 15-ml-Röhrchen mit dem/den Tupfer/n sollte so schnell wie möglich in der Kühlkette vorsichtig zum Krankenhauslabor transportiert werden.

Probenbearbeitung:

Die erhaltenen Tupfer im 15-ml-Röhrchen sollten mit einem Vortex-Mischer 10 Sekunden lang kräftig geschüttelt werden, um Zellen von der Tupferspitze zu lösen. Anschließend sollten beide Tupfer mit einer Pinzette aus dem Röhrchen entfernt und entsorgt werden. Das VTM sollte in zwei vorbeschriftete, sterile Kryoröhrchen mit der korrekten Patienten-ID aufgeteilt werden. Ein Kryoröhrchen sollte sofort in einen Gefrierschrank (-70 °C) gestellt werden, während das andere Kryoröhrchen für molekulare Tests mittels Echtzeit-PCR im MASRI-Molekularlabor verwendet wird.

Die Proben werden mittels Echtzeit-Multiplex-PCR mit dem FTD-respiratorischen 33-Kit auf das Vorhandensein einer breiten Palette von Atemwegserregern getestet, darunter: Influenza A und die Subtypen Influenza A Pdm(H1N1) sowie saisonale H3-, Influenza B-, Influenza C- und Parainfluenzaviren 1, 2, 3 und 4; Coronaviren NL63, 229E, OC43 und HKU1; menschliche Metapneumoviren A und B; Rhinovirus; respiratorische Synzytialviren A und B; Adenovirus; Enterovirus; Parechovirus; Boca-Virus; Pneumocystis jirovecii; Mycoplasma pneumoniae; Chlamydia pneumoniae; Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenza Typ B (HIB-Test erkennt auch Haemophilus parahaemolyticus, der mit Pharyngitis assoziiert ist); Staphylococcus aureus; Moraxella catarrhalis; Bordetella spp. (außer Bordetella parapertussis), Klebsiella pneumoniae; Legionella-Arten und Salmonella-Arten. Fälle, bei denen der Verdacht auf MERS-CoV oder HPAI H5N1 besteht, entsprechend ihrer Kontaktgeschichte mit Vögeln oder Kamelen oder unter Bezugnahme auf die WHO. Verdachtsfälle auf MERS-CoV oder Vogelgrippe werden anhand des CDC-Protokolls getestet.

Probenlagerung:

Das zweite Aliquot der Proben wird in Gefrierschränken (-70 °C) im MASRI MOLECULAR-Labor zur externen Qualitätssicherung (EQA) gelagert, indem vor Ort Tests durch zufällige Auswahl von Proben mit unterschiedlichen Ergebnissen durchgeführt und von anderen NAMRU-3-Laborexperten erneut getestet werden in MASRI-Molekularlaboren; Die Proben können auch für weitere Tests mittels NGS oder zur Virusisolierung in MASRI-Molekularlaboren verwendet werden.

Probentransfer:

Alle Proben werden in den Labors der Fakultät für Medizin des Ain Shams Research Institute – Molecular Unit aufbewahrt und nicht an andere Labors weitergegeben.

B- Erkunden Sie Studientests auf COVID-19 mit gebrauchsfertigen RT-Echtzeit-Testassays – VIRAL-RNA-ISOLIERUNG: Verwendung im Handel erhältlicher Kits von Thermofisher oder anderen empfohlenen Unternehmen. Die Arbeiten werden in Schränken der Biosicherheitsstufe 2 unter völlig sterilen Bedingungen durchgeführt. -

COVID-19-ERKENNUNG:

Mithilfe der Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) kann der Test an Atemwegsproben durchgeführt werden, die mit verschiedenen Methoden gewonnen wurden, einschließlich Nasopharynxabstrichen oder Sputumproben. Ergebnisse liegen in der Regel innerhalb weniger Stunden vor. Molekulare Methoden nutzen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zusammen mit Nukleinsäuretests und anderen fortschrittlichen Analysetechniken, um das genetische Material des Virus mithilfe der Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit für diagnostische Zwecke nachzuweisen. Im Handel erhältliche Kits von hvd, thermofisher und anderen.

C- Genomsequenzierung (NGS) für mögliche positive Covid-19-Proben. Die gezielte Next-Generation-Sequenzierung (NGS) von Ion Torrent ermöglicht einen optimierten Forschungsworkflow für die vollständige Genomsequenzierung und epidemiologische Studien von SARS-CoV-2 (dem für COVID-19 verantwortlichen Coronavirus). ). Durch die Verwendung eines Satzes hochspezifischer, universeller Coronavirus-Primer in Kombination mit einem High-Fidelity-Mastermix werden alle Genomsegmente amplifiziert und die DNA-Amplikons auf jedem Ion Torrent-System sequenziert, um eine hochpräzise Coronavirus-Typisierung in weniger als einem Tag zu ermöglichen. Das Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel besteht aus 2 Pools mit Arnplicons mit einer Länge von 125275 bp bis zur vollständigen Sequenzierung des viralen Genoms