Retrospektiv studie om alvorlig luftveissykdom for å få tilgang til tilstedeværelsen av COVID-19 (Explore)

A- Metodikk tatt i bruk i den retrospektive studien:

Bestemmelse av prøvestørrelse:

500 saker presentert fra november 2019 til februar 2020 vil bli inkludert i utforske studie fra Ain shams universitetssykehus

Samling av prøver:

Orofaryngeale og nasofaryngeale vattpinner (NP) for innlagte SARI-pasienter:

Klinikere i indremedisinske, bryst- og pediatriske sykehus vil være ansvarlige for å skaffe orofaryngeale og nasofaryngeale vattpinner for laboratorietesting fra alle sykehuspasienter som oppfyller WHOs standard SARI-tilfelledefinisjon.

Orofaryngeal vattpinne:

En tørr steril spiss flokket med nylonfiberpinne-applikator bør brukes til å tørke den bakre svelget. Vaskepinnen skal plasseres i et 15 ML sentrifugerør merket med pasientens unike ID og inneholdende 2mL viralt transportmedium (VTM). Applikatorpinnen kuttes deretter av.

Nasofaryngeal vattpinne:

En fleksibel, steril spiss flokket med nylonfiber vattpinneapplikator settes inn i neseboret og tilbake til nasopharynx og la stå på plass i noen sekunder. Den trekkes deretter sakte tilbake med en roterende bevegelse. For SARI-pasienter legges vattpinnen i samme sentrifugerør som den orofaryngeale vattpinne merket med pasientens unike ID og skaftet kuttes. 15 ml-røret som inneholder vattpinnen/penne bør transporteres forsiktig til sykehuslaboratoriet så snart som mulig i kjølekjeden.

Eksempelbehandling:

De mottatte vattpinnene inne i 15 ml-røret skal omrøres kraftig i 10 sekunder med en virvelmikser for å frigjøre celler fra vattpinnespissen, og deretter skal begge vattpinnene fjernes fra røret og kastes med en pinsett. VTM bør deles i 2 forhåndsmerkede, sterile kryovialer med riktig pasient-ID. Det ene kryovialet skal umiddelbart plasseres i en fryser (-70°C), mens det andre kryovialet vil bli brukt til molekylær testing ved sanntids PCR ved MASRI-molekylært laboratorium.

Prøver vil bli testet ved sanntids multipleks PCR ved bruk av FTD-respiratorisk 33-sett for tilstedeværelse av et bredt panel av respiratoriske patogener som inkluderer: influensa A og subtyper influensa A Pdm(H1N1) og sesongmessige H3, influensa B, influensa C, parainfluensavirus 1, 2, 3 og 4; koronavirus NL63, 229E, OC43 og HKU1; humane metapneumovirus A og B; rhinovirus; respiratoriske syncytiale virus A og B; adenovirus; enterovirus; parechovirus; Boca-virus; Pneumocystis jirovecii; Mycoplasma pneumoniae; Chlamydia pneumoniae; Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influensa type B (HIB-analysen oppdager også Haemophilus parahaemolyticus som er assosiert med faryngitt); Staphylococcus aureus; Moraxella catarrhalis; Bordetella spp. (unntatt Bordetella parapertussis), Klebsiella pneumoniae; Legionella-arter og Salmonella-arter. Tilfeller mistenkt med MERS-CoV eller HPAI H5N1 i henhold til deres historie med kontakt med fugler eller kameler eller med henvisning til WHO mistenkte tilfeller av MERS-CoV eller fugleinfluensa vil bli testet ved hjelp av CDC-protokollen.

Eksempel lagring:

Den andre alikvoten av prøvene vil bli lagret i frysere (-70°C) ved MASRI MOLEKULAR laboratorium for ekstern kvalitetssikring (EQA) ved testing på stedet gjennom tilfeldig utvalg av prøver med forskjellige resultater og test dem på nytt av annen NAMRU-3 laboratorieekspertise i MASRI molekylære laboratorier; prøvene kan også brukes til videre testing ved NGS eller virusisolering i MASRI molekylære laboratorier.

Eksempeloverføring:

Alle prøver vil bli oppbevart i Det medisinske fakultet Ain Shams Research Institute- Molecular Unit-laboratorier og vil ikke bli overført til andre laboratorier.

B- Utforsk studietesting for COVID-19 med bruksklare RT-sanntidstestanalyser - VIRAL RNA ISOLASJON: Bruk kommersielt tilgjengelige sett levert av thermofisher eller andre anbefalte selskaper. Arbeid vil bli utført i Biosafety nivå 2-skap under fullstendig sterile forhold. -

COVID-19 DETEKSJON:

Ved å bruke sanntids revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon RT-PCR kan testen gjøres på luftveisprøver oppnådd ved forskjellige metoder, inkludert nasofaryngeal vattpinne eller sputumprøve. Resultatene er vanligvis tilgjengelige innen noen få timer. Molekylære metoder utnytter polymerasekjedereaksjon (PCR) sammen med nukleinsyretester og andre avanserte analytiske teknikker, for å oppdage det genetiske materialet til viruset ved å bruke sanntids revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon for diagnostiske formål. Kommersielt tilgjengelige sett levert av hvd, thermofisher og andre.

C- Genomsekvensering (NGS) for mulige positive covid-19 prøver Ion Torrent målrettet neste generasjons sekvensering (NGS) muliggjør en strømlinjeformet forskningsarbeidsflyt for fullstendig genomsekvensering og epidemiologiske studier av SARS-CoV-2 (koronaviruset som er ansvarlig for COVID-19) ). Gjennom bruk av et sett med svært spesifikke, universelle koronavirusprimere i kombinasjon med en high-fidelity mastermix, blir alle genomiske segmenter amplifisert og DNA-amplikonene sekvensert på et hvilket som helst Ion Torrent-system for å levere svært nøyaktig koronavirustyping på under en dag. Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2-forskningspanelet består av 2 bassenger med arnplikoner fra 125275 bp iri-lengde for fullstendig viral genomsekvensering