Retrospectief onderzoek naar ernstige luchtwegaandoeningen om toegang te krijgen tot de aanwezigheid van COVID-19 (Explore)

A- Methodologie toegepast in de retrospectieve studie:

Bepaling van de steekproefomvang:

500 gevallen gepresenteerd van november 2019-februari 2020 zullen worden opgenomen in verkennend onderzoek van Ain Shams University Hospitals

Verzameling van monsters:

Orofaryngeale en nasofaryngeale uitstrijkjes (NP) voor gehospitaliseerde SARI-patiënten:

Clinici in de interne geneeskunde, borst- en kinderziekenhuizen zijn verantwoordelijk voor het verkrijgen van orofaryngeale en nasofaryngeale uitstrijkjes voor laboratoriumtesten van alle gehospitaliseerde patiënten die voldoen aan de standaard SARI-casusdefinitie van de WHO.

Orofarynx uitstrijkje:

Een droge, steriele punt met een wattenstaafje van nylonvezel moet worden gebruikt om de achterste keelholte schoon te maken. Het wattenstaafje moet in een centrifugebuis van 15 ml worden geplaatst, gelabeld met het unieke ID van de patiënt en die 2 ml viraal transportmedium (VTM) bevat. De applicatorstick wordt vervolgens afgesneden.

Nasofarynx uitstrijkje:

Een flexibele, steriele tip met een wattenstaafje van nylonvezel wordt in het neusgat en terug naar de nasopharynx gestoken en een paar seconden op zijn plaats gelaten. Vervolgens wordt het langzaam met een draaiende beweging teruggetrokken. Voor SARI-patiënten wordt het uitstrijkje in dezelfde centrifugebuis geplaatst als het orofaryngeale uitstrijkje, gelabeld met het unieke ID van de patiënt, en wordt de schacht doorgesneden. De tube van 15 ml met de swab(s) moet zo snel mogelijk in de koelketen zorgvuldig naar het ziekenhuislaboratorium worden vervoerd.

Voorbeeldverwerking:

De ontvangen uitstrijkjes in de buis van 15 ml moeten gedurende 10 seconden krachtig worden geroerd met behulp van een vortexmenger om de cellen van de tip van het uitstrijkje te bevrijden, waarna beide uitstrijkjes uit de buis moeten worden verwijderd en met een pincet moeten worden weggegooid. De VTM moet worden opgesplitst in 2 voorgelabelde, steriele cryoflesjes met de juiste patiënt-ID. Eén cryobuisje moet onmiddellijk in een vriezer (-70°C) worden geplaatst, terwijl het andere cryobuisje wordt gebruikt voor moleculaire testen door middel van real-time PCR in het MASRI-moleculair laboratorium.

Monsters zullen worden getest door middel van real-time multiplex PCR met behulp van de FTD-respiratoire 33-kit op de aanwezigheid van een breed panel van respiratoire pathogenen, waaronder: influenza A en subtypes influenza A Pdm (H1N1) en seizoensgebonden H3, influenza B, influenza C, para-influenzavirussen 1, 2, 3 en 4; coronavirussen NL63, 229E, OC43 en HKU1; menselijke metapneumovirussen A en B; rhinovirus; respiratoire syncytiële virussen A en B; adenovirus; enterovirus; parechovirus; Boca-virus; Pneumocystis jirovecii; Mycoplasma pneumoniae; Chlamydia pneumoniae; Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenza type B (HIB-assay detecteert ook Haemophilus parahaemolyticus die geassocieerd is met faryngitis); Staphylococcus aureus; Moraxella catarrhalis; Bordetella spp. (behalve Bordetella parapertussis), Klebsiella pneumoniae; Legionellasoorten en Salmonellasoorten. Gevallen die worden verdacht van MERS-CoV of HPAI H5N1 op basis van hun geschiedenis van contact met vogels of kamelen of met verwijzing naar de WHO-verdachte gevallen van MERS-CoV of aviaire influenza, zullen worden getest met behulp van het CDC-protocol.

Voorbeeld opslag:

Het tweede deel van de monsters wordt opgeslagen in vriezers (-70°C) in het MASRI MOLECULAR-laboratorium voor externe kwaliteitsborging (EQA) door ter plaatse te testen door willekeurige selectie van monsters met verschillende resultaten en ze opnieuw te testen door andere NAMRU-3-laboratoriumexpertise in moleculaire laboratoria van MASRI; de monsters kunnen ook worden gebruikt voor verder testen door NGS of virusisolatie in MASRI moleculaire laboratoria.

Voorbeeldoverdracht:

Alle monsters worden bewaard in de laboratoria van het Ain Shams Research Institute-Molecular Unit van de Faculteit Geneeskunde en worden niet overgebracht naar andere laboratoria.

B- Ontdek studietesten voor COVID-19 met gebruiksklare RT-realtime testassays - VIRAL RNA ISOLATION: Gebruik van in de handel verkrijgbare kits geleverd door thermofisher of andere aanbevolen bedrijven. Er zal gewerkt worden in Biosafety level 2 kasten onder volledig steriele omstandigheden. -

COVID-19-DETECTIE:

Met behulp van real-time reverse transcriptie polymerasekettingreactie RT-PCR kan de test worden uitgevoerd op ademhalingsmonsters die op verschillende manieren zijn verkregen, waaronder een nasofaryngeaal uitstrijkje of sputummonster. Resultaten zijn over het algemeen binnen een paar uur beschikbaar. Moleculaire methoden maken gebruik van polymerasekettingreactie (PCR) samen met nucleïnezuurtesten en andere geavanceerde analytische technieken om het genetische materiaal van het virus te detecteren met behulp van real-time reverse transcriptie polymerasekettingreactie voor diagnostische doeleinden. In de handel verkrijgbare kits geleverd door hvd, thermofisher en anderen.

C- Genome sequencing (NGS) voor mogelijk positieve covid-19-samples Ion Torrent-gerichte next-generation sequencing (NGS) maakt een gestroomlijnde onderzoeksworkflow mogelijk voor volledige genoomsequencing en epidemiologische studies van SARS-CoV-2 (het coronavirus dat verantwoordelijk is voor COVID-19 ). Door het gebruik van een set zeer specifieke, universele coronavirus-primers in combinatie met een high-fidelity mastermix, worden alle genomische segmenten geamplificeerd en de DNA-amplicons gesequenced op elk Ion Torrent-systeem om binnen een dag zeer nauwkeurige coronavirus-typering te leveren. Het Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel bestaat uit 2 pools met arnplicons variërend van 125275 bp iri-lengte voor volledige virale genoomsequencing