Vlastní odběr vzorků u neúčastnic screeningu rakoviny děložního čípku: Test DNA a molekulární třídění u HPV pozitivních žen

Studie bude provedena v regionu Toskánsko včetně tří organizovaných screeningových programů: Florencie, Viareggio a Carrara. V těchto oblastech programy cervikálního screeningu aktivně vyzývají všechny rezidentní ženské populace ve věku 34–64 let k testování HPV (Human Papilloma Virus) jako primárního screeningového testu (Florence a Viareggio), podle nového protokolu pro screening rakoviny děložního čípku v regionu Toskánsko, nebo Pap-test každé 3 roky (Carrara). Ženy ve věku 34-64 let, které byly pozvány do screeningového programu v předchozím kole screeningu a nereagovaly po dobu alespoň 3 let, budou mít nárok na odvolání pošty.

Ve 3 zapojených screeningových programech je každoročně pozváno k účasti na screeningovém programu asi 63 000 ve věkové třídě 34-64 let a asi 40 % žen na pozvání do programu nereagovalo. Z nich bude 8000 způsobilých žen postupně vybraných ze seznamů náhodně rozděleno do dvou skupin. Cílem je vyhodnotit míru odezvy na pozvání k odběru vaginálně-cervikálního vzorku pro testování infekce hr-HPV ve srovnání se standardním písemným upomínkovým dopisem. Randomizaci bude provádět centrálně koordinační centrum (ISPO) pomocí počítačem generovaných náhodných čísel. V prvním roce bude náhodný vzorek 4000 způsobilých žen ze 4 screeningových programů pozván k účasti ve studii, která odešle vlastní odběr vzorků domů. V kontrolním rameni ženy obdrží obvyklé odvolání s novým zvacím dopisem s předem stanoveným termínem (lze jej přesunout telefonickým hovorem) k provedení screeningového testu na HPV v místních obvodech nebo na klinice. V intervenčním rameni vybraném pro příjem vlastního odběru vzorků doma vyšetřovatelé náhodně rozdělí ženy do 2 různých zařízení pro vlastní odběr vzorků, které se liší tím, zda mají nebo nemají konzervační pufr.

Takže skupina žen zařazených do intervenční větve (4000) bude dále randomizována v poměru 1:1 pro příjem zařízení S-wet nebo S-dry.

Za předpokladu, že shoda tradiční metody se zvacím dopisem je rovna 15 % (Giorgi Rossi 2010), je tato studie navržena tak, aby byla schopna odhalit absolutní rozdíl 1,5 % nebo větší v míře návštěvnosti při konvenčních úrovních síla (80 %) a významnost (95 %, jednostranný test) s plánovanou velikostí vzorku 8000 žen. Za předpokladu, že velikost vzorku je rovna 2000 ženám pro každé vzorkovací zařízení, významný rozdíl se rovná nebo je větší než 4,0 procentní body více či méně, vezmeme-li v úvahu míru HPV pozitivních asi 21 % (Giorgi Rossi 2010) se stejnou silou a významností.

Studie bude před zahájením předložena ke schválení koordinačnímu centru a místním etickým výborům oblasti Vasta. Každá žena ve studijních skupinách obdrží upozorňující dopis s vysvětlením, že místní program veřejného screeningu jí zcela zdarma poskytne krabičku obsahující zařízení pro vlastní odběr vzorků, aby si mohla provést screeningový test na HPV přímo doma. Po 1 týdnu každý screeningový program zapojený do studie zašle běžnou poštou náhodně vybraným ženám domů dopis s pozváním k účasti na HPV screeningovém programu a krabici s: zařízením pro odběr vzorků, používaným letákem pro screening HPV v programu regionu Toskánsko. Informace související se studií, pokyny k provedení vlastního odběru vzorků, předtištěné štítky k umístění na zkumavku, formulář informovaného souhlasu k podpisu, dotazník a předem orazítkovaná obálka pro vrácení sady pro vlastní odběr vzorků. Dotazníky budou zasílány se samoodběrovým zařízením včetně položek souvisejících s: datem posledního Pap-testu u žen, dotazy na výkon samoodběru (bolest, rozpaky, proveditelnost), co bylo při samoodběru nejvíce oceněno (provedení sebe, soukromí, nepřítomnost lékaře, nepřítomnost zrcátka) a co se jim na samoodběru nelíbilo (bolest, přístroj, instrukce). Všechny informace budou shromažďovány pomocí 5bodových ordinálních stupnic obecné přijatelnosti. Ženy, které se rozhodnou pro účast ve studii, mohou poslat přímo klasickou poštou na místní screeningový program předem orazítkovanou obálku s vlastním odběrem vzorků, dotazník a podepsaný informovaný souhlas (který bude obsahovat i oprávnění k telefonickému kontaktu). Ve druhém roce studia ve Florencii vyšetřovatelé také vyhodnotí možnost zapojit Drogerie do distribuce vlastního odběru vzorků. V tomto případě bude 500 randomizovaných žen pozváno dopisem k provedení vlastního odběru vzorků pro screeningový test na HPV s vyzvednutím zařízení v lékárně. Seznam drogerií, které souhlasily se zařazením do studie, bude k dispozici v pozvánce. Bude hodnocen vliv na compliance a spokojenost žen. Všechny HPV analýzy a molekulární testy budou provedeny v Molecular Laboratory of ISPO , centrální laboratoři pro HPV screeningový test v regionu Toskánsko

Test DNA cobas4800 HPV:

HPV bude hodnocen stejným HPV testem, jaký se používá při běžném screeningu: Cobas 4800 HPV test (Roche Diagnostics) je kvalitativní test in vitro, který využívá amplifikaci cílové DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase k detekci 14 vysoce rizikové (HR) typy HPV v jediné analýze. Jedná se o kvalitativní multiplexní test, který poskytuje specifické genotypové informace pro HPV typy 16 a 18, přičemž současně detekuje dalších 12 vysoce rizikových typů HPV (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) jako společný výsledek. ß-globin z buněčného vstupu se používá jako vnitřní kontrola k posouzení kvality vzorku. Test se provádí na zcela automatizovaném systému cobas 4800 (Roche Diagnostics) podle pokynů výrobce; vzorek je považován za pozitivní podle specifického algoritmu softwaru systému Cobas.

Vedení zařazených žen HPV negativní ženy obdrží doma výsledky screeningového testu a po 5 letech jsou znovu pozvány podle protokolu screeningu HPV. Všechny ženy, které byly pozitivní na HPV, budou telefonicky kontaktovány za účelem provedení kolposkopie a poradenství ohledně rizika HPV a rakoviny děložního čípku. Pokud bude kolposkopie pozitivní, bude odebrána biopsie a každá žena bude sledována podle protokolu HPV screeningového programu v Toskánsku. Pokud bude kolposkopie negativní, budou ženy do jednoho roku znovu pozvány ke kontrole pomocí HPV testu. Během kolposkopie bude také proveden Pap test, který bude vodítkem pro postkolposkopické sledování podle protokolu schváleného v Toskánském regionu. Pokud se žena s hr-HPV nezúčastnila, bylo snaha ji znovu kontaktovat telefonicky a následně i dopisem.

Molekulární třídění HPV pozitivních žen

Genotypizace HPV:

U všech hrHPV pozitivních vzorků bude provedena specifická genotypizace. Extrahovaná DNA bude genotypována. U všech HPV pozitivních vzorků odebraných z vlastního odběru provedou výzkumníci kvantitativní methylační analýzy, aby získali kvantifikaci stavu metylace vyšetřovaných CpG pomocí DNA extrahované pro genotypizaci. Vyšetřovatelé vyhodnotí methylaci CpG ostrovů v promotorových oblastech genů a mikroRNA, jako je CADM1 (buněčná adhezní molekula 1), MAL (myelinový a lymfocytární protein) a hsa-miR-124- a stav methylace oblastí HPV L1 a L2 . Výzkumníci budou pro každý typ zkoumat CpG umístěné poblíž sekvenční pozice HPV16 CpG, které byly zdůrazněny jako spojené se zvýšeným rizikem cervikálního intraepiteliálního neoplastického (CIN2+) onemocnění: L1 nukleotidové pozice 5601-5616 a 6457; Nukleotidová pozice L2 4261.

Bisulfitová modifikace: Vzorky genomové DNA budou podrobeny bisulfitové modifikaci pomocí komerční EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Bisulfitově modifikovaná genomová DNA bude okamžitě použita pro pyrosekvenování nebo uložena při -80 °C.

Kontroly lidské syntetické methylované a nemethylované DNA pro lidské geny a DNA z buněčné linie CaSki nebo kontrola WHO (Světová zdravotnická organizace) HPV16-DNA pro virové geny budou zahrnuty v každé modifikační sadě pro kontrolu účinnosti modifikace.

Methylační stav: Methylační stav ve vybraných genech bude hodnocen na bisulfitově modifikované DNA. Testy budou prováděny s použitím primerů vybraných podle publikovaných sekvencí (Hesselink AT et al. Mirabello L a kol., Wentzensen N a kol.). Nejsou-li k dispozici, budou primery navrženy pomocí specifického softwaru. Pro reference genové sekvence budou vytvořena spojení s dostupnými genovými bankami. Předběžná PCR reakce bude provedena v celkovém objemu 35 mikroL obsahujících 1X KCl, 2mM MgCl2, 200 mikroM dNTP, 0,5 mikroM každého primeru (antisense biotinylovaného), 1,75 U Taq polymerázy a 6 mikroL modifikované DNA se správným termocyklickým profilem. Amplifikace a měření v reálném čase bylo provedeno v systému 7500 ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). V každém běhu budou zahrnuty bisulfitově modifikované kontroly pro methylovaný a nemethylovaný stav buňky a virového genu.

Výsledky genotypizace a methylace budou korelovány z hlediska senzitivity a specificity k histologickému výsledku a výsledkům sledování u HPV pozitivních žen s klinicky významným onemocněním děložního čípku a bez něj diagnostikovaným během dvouletého období sledování.

Role každé jednotky zapojené do studie a časová osa V prvním roce studie ISPO vybere a randomizuje ženy, vytvoří studijní databázi a počítačovou validaci softwaru. Budou připraveny krabice a veškerý materiál pro zasílání samoodběrových zařízení.

Každé screeningové centrum pozve ženy, odešle krabici se samoodběrovým zařízením, obdrží samoodběrové zařízení od pozvaných žen, zaregistruje je do databáze, odešle vzorky na ISPO. ISPO L.R.P.O (Regionální laboratoř onkologické prevence) provede hr-HPV testování a výsledky zašle do každého screeningového centra. Každé screeningové centrum obdrží výsledky hr-HPV od ISPO a zašle je ženě. V případě HPV pozitivních výsledků místní screeningové centrum ženu telefonicky kontaktuje za účelem kolposkopického vyšetření, provede kolposkopii a každou další kontrolní návštěvu, zaznamená výsledky a údaje z dotazníků do databáze a bude se podílet na vyhodnocení výsledků.

Ve druhém roce ISPO vyhodnotí proveditelnost distribuce vlastního odběru vzorků pomocí lékáren a pozvaných žen za tímto účelem provedením testu hr-HPV u respondentek. ISPO provede také typizaci HPV a metylační profily, zaznamená všechna data do databáze studie, provede statistickou analýzu a vyhodnocení výsledků.