Selbst gesammelte Probenahme bei nicht teilnehmenden Gebärmutterhalskrebs-Vorsorgeuntersuchungen: DNA-Test und molekulare Triage für HPV-positive Frauen

Die Studie wird in der Toskana durchgeführt und umfasst drei organisierte Screening-Programme: Florenz, Viareggio und Carrara. In diesen Gebieten laden Zervix-Screening-Programme aktiv alle ansässigen weiblichen Bevölkerung im Alter von 34-64 Jahren zum HPV-Test (Humanes Papillomavirus) als primären Screening-Test ein (Florenz und Viareggio), gemäß dem neuen Protokoll für das Screening auf Gebärmutterhalskrebs in der Region Toskana, oder Pap-Test alle 3 Jahre (Carrara). Frauen im Alter von 34 bis 64 Jahren, die in der vorherigen Screening-Runde vom Screening-Programm eingeladen wurden und mindestens 3 Jahre lang nicht geantwortet haben, haben Anspruch auf einen Rückruf per Post.

In den 3 beteiligten Screening-Programmen werden jedes Jahr etwa 63.000 in der Altersklasse 34-64 Jahre eingeladen, am Screening-Programm teilzunehmen, und etwa 40 % der Frauen sind der Einladung des Programms nicht gefolgt. Aus diesen werden 8000 teilnahmeberechtigte Frauen, die nacheinander aus den Listen ausgewählt werden, in zwei Gruppen randomisiert. Ziel ist es, die Rücklaufquote auf die Einladung zur selbst entnommenen vaginal-zervikalen Probe zur hr-HPV-Infektionstestung im Vergleich zum üblichen schriftlichen Erinnerungsschreiben zu evaluieren. Die Randomisierung erfolgt zentral durch die Koordinierungsstelle (ISPO) anhand computergenerierter Zufallszahlen. Im ersten Jahr wird eine Zufallsstichprobe von 4000 in Frage kommenden Frauen aus den 4 Screening-Programmen eingeladen, an der Studie teilzunehmen und eine Selbstprobe zu Hause zu senden. In der Kontrollgruppe erhalten die Frauen den üblichen Rückruf mit einem neuen Einladungsschreiben mit einem vorangestellten Termin (kann per Telefonanruf verschoben werden), um einen HPV-Screening-Test in den örtlichen Bezirken oder Kliniken durchzuführen. In dem Interventionsarm, der für die Selbstentnahme zu Hause ausgewählt wurde, weisen die Ermittler die Frauen nach dem Zufallsprinzip 2 verschiedenen Selbstentnahmegeräten zu, die sich darin unterscheiden, ob sie einen Konservierungsmittelpuffer haben oder nicht.

Daher wird die Gruppe von Frauen, die dem Interventionsarm (4000) zugeordnet sind, 1:1 weiter randomisiert, um ein S-wet- oder S-dry-Gerät zu erhalten.

Unter der Annahme, dass die Compliance für die traditionelle Methode mit einem Einladungsschreiben gleich 15 % ist (Giorgi Rossi 2010), ist die vorliegende Studie so konzipiert, dass sie einen absoluten Unterschied von 1,5 % oder mehr in der Anwesenheitsquote mit einem herkömmlichen Niveau von feststellen kann Power (80 %) und Signifikanz (95 %, einseitiger Test) mit einer geplanten Stichprobengröße von 8000 Frauen. Geht man von einer Stichprobengröße von 2000 Frauen für jedes Stichprobengerät aus, ergibt sich ein signifikanter Unterschied gleich oder größer als 4,0 Prozentpunkte mehr oder weniger, wenn man eine HPV-Positivrate von etwa 21 % (Giorgi Rossi 2010) mit gleicher Aussagekraft und Signifikanz berücksichtigt.

Die Studie wird vor Beginn dem Koordinierungszentrum und den lokalen Ethikkommissionen des Gebiets Vasta zur Genehmigung vorgelegt. Jede Frau in den Studiengruppen erhält einen Benachrichtigungsbrief, in dem erklärt wird, dass das örtliche öffentliche Screening-Programm ihr völlig kostenlos eine Box mit einem Selbstprobengerät zur Verfügung stellen würde, um einen Selbst-HPV-Screening-Test direkt zu Hause durchzuführen. Nach 1 Woche wird jedes an der Studie beteiligte Screening-Programm per Post an die randomisierten Frauen ein Einladungsschreiben zur Teilnahme am HPV-Screening-Programm und eine Schachtel mit: einem Gerät zur Selbstprobenentnahme, einer HPV-Screening-Broschüre in Gebrauch per Post schicken im Toskana-Regionsprogramm. Informationen zur Studie, Anweisungen zur Durchführung der Selbstprobenahme, vorgedruckte Etiketten zum Aufkleben auf das Röhrchen, die Einverständniserklärung zum Unterschreiben, der Fragebogen und ein vorfrankierter Umschlag zum Zurücksenden des Selbstprobenahme-Kits. Die Fragebögen werden mit dem Gerät zur Selbstentnahme verschickt, einschließlich Elementen zu: Datum des letzten Pap-Tests der Frau, Fragen zur Leistung der Selbstentnahme (Schmerz, Verlegenheit, Durchführbarkeit), was bei der Selbstentnahme am meisten geschätzt wurde (doing it by Privatsphäre, Abwesenheit eines Arztes, kein Spekulum) und was ihnen an der Selbstentnahme nicht gefiel (Schmerzen, Gerät, Anleitung). Alle Informationen werden anhand von 5-Punkte-Ordinskalen zur allgemeinen Akzeptanz erhoben. Frauen, die sich für die Teilnahme an der Studie entscheiden, können den vorfrankierten Umschlag mit der Selbstprobenahme, dem Fragebogen und der unterschriebenen Einwilligungserklärung (die auch die Genehmigung für den telefonischen Kontakt enthält) direkt per Post an das lokale Screening-Programm senden. Im zweiten Studienjahr in der Stadt Florenz werden die Ermittler auch die Möglichkeit prüfen, Drogerien in die Verteilung von Selbstproben einzubeziehen. In diesem Fall werden 500 randomisierte Frauen per Brief eingeladen, eine Selbstentnahme für den HPV-Screening-Test durchzuführen, um das Gerät in der Apotheke zu sammeln. Eine Liste der Apotheken, die der Teilnahme an der Studie zugestimmt haben, erhalten Sie im Einladungsschreiben. Die Auswirkungen auf Compliance und Zufriedenheit von Frauen werden evaluiert. Alle HPV-Analysen und molekularen Tests werden im Molekularlabor der ISPO durchgeführt, dem zentralen Labor für HPV-Screening-Tests in der Region Toskana

DNA cobas4800 HPV-Test:

HPV wird mit demselben HPV-Test bewertet, der auch beim regulären Screening verwendet wird: Der Cobas 4800 HPV-Test (Roche Diagnostics) ist ein qualitativer In-vitro-Test, der die Amplifikation der Ziel-DNA durch Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von 14 nutzt Hochrisiko-(HR)-HPV-Typen in einer einzigen Analyse. Es handelt sich um einen qualitativen Multiplex-Assay, der spezifische Genotypisierungsinformationen für die HPV-Typen 16 und 18 liefert und gleichzeitig die anderen 12 Hochrisiko-HPV-Typen (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 und 68) als zusammengefasstes Ergebnis. ß-Globin aus zellulärem Input wird als interne Kontrolle zur Beurteilung der Probenqualität verwendet. Der Test wird auf dem vollständig automatisierten cobas 4800 System (Roche Diagnostics) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt; eine Probe wird gemäß dem spezifischen Algorithmus der Cobas-Systemsoftware als positiv angesehen.

Management von eingeschriebenen Frauen HPV-negative Frauen erhalten zu Hause die Ergebnisse des Screening-Tests und werden gemäß dem HPV-Screening-Protokoll nach 5 Jahren erneut eingeladen. Alle Frauen, die HPV-positiv sind, werden telefonisch kontaktiert, um eine Kolposkopie und eine Beratung zum HPV- und Gebärmutterhalskrebsrisiko durchzuführen. Wenn die Kolposkopie positiv ist, wird eine Biopsie entnommen und jede Frau wird gemäß dem Protokoll des HPV-Screening-Programms in der Toskana überwacht. Wenn die Kolposkopie negativ ausfällt, werden die Frauen erneut eingeladen, sich innerhalb eines Jahres einer Kontrolle mit einem HPV-Test zu unterziehen. Während der Kolposkopie wird auch ein Pap-Test durchgeführt, um die postkolposkopische Nachsorge gemäß dem in der Toskana genehmigten Protokoll zu leiten. Bei Nichterscheinen einer Frau mit hr-HPV wurde versucht, sie erneut telefonisch und dann auch per Brief zu kontaktieren.

Molekulare Triage von HPV-positiven Frauen

HPV-Genotypisierung:

Bei allen hrHPV-positiven Proben wird eine spezifische Genotypisierung durchgeführt. Die extrahierte DNA wird genotypisiert. In allen HPV-positiven selbst entnommenen Proben führen die Prüfärzte quantitative Methylierungsanalysen durch, um eine Quantifizierung für den Methylierungsstatus der untersuchten CpGs zu erhalten, wobei DNA verwendet wird, die für die Genotypisierung extrahiert wurde. Die Forscher werden die Methylierung von CpG-Inseln innerhalb von Promotorregionen von Genen und microRNAs wie CADM1 (Cell Adhäsionsmolekül 1), MAL (Myelin- und Lymphozytenprotein) und hsa-miR-124 sowie den Methylierungsstatus der HPV-Regionen L1 und L2 bewerten . Die Forscher werden für jeden Typ die CpGs untersuchen, die sich in der Nähe der Sequenzposition von HPV16-CpGs befinden, die als mit einem erhöhten Risiko einer zervikalen intraepithelialen neoplastischen Erkrankung (CIN2+) assoziiert hervorgehoben wurden: L1-Nukleotidpositionen 5601–5616 und 6457; L2-Nukleotidposition 4261.

Bisulfit-Modifikation: Genomische DNA-Proben werden mit dem kommerziellen EpiTect Bisulfit-Kit (QIAGEN) einer Bisulfit-Modifikation unterzogen. Die Bisulfit-modifizierte genomische DNA wird sofort für die Pyrosequenzierung verwendet oder bei -80 °C gelagert.

Menschliche synthetische methylierte und unmethylierte DNA-Kontrollen für menschliche Gene und DNA aus der CaSki-Zelllinie oder eine HPV16-DNA-Kontrolle der WHO (Weltgesundheitsorganisation) für virale Gene werden in jedem Modifikationssatz enthalten sein, um die Modifikationseffizienz zu überprüfen.

Methylierungsstatus: Der Methylierungsstatus in den ausgewählten Genen wird anhand der Bisulfit-modifizierten DNA bewertet. Die Assays werden unter Verwendung von Primern durchgeführt, die gemäß veröffentlichten Sequenzen (Hesselink AT et al. Mirabello L. et al., Wentzensen N. et al.). Wenn nicht verfügbar, werden Grundierungen mit einer speziellen Software entworfen . Links zu verfügbaren Genbanken werden für Gensequenzreferenzen eingerichtet. Eine vorläufige PCR-Reaktion wird in einem Gesamtvolumen von 35 Mikrol durchgeführt, das 1X KCl, 2 mM MgCl2, 200 Mikromol dNTPs, 0,5 Mikromol jedes Primers (antisense-biotinyliert), 1,75 U Taq-Polymerase und 6 Mikroliter modifizierte DNA mit dem richtigen Thermocycling-Profil enthält. Amplifikation und Echtzeitmessung wurden im 7500 ABI-System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Bisulfit-modifizierte Kontrollen für den methylierten und unmethylierten Status der Zelle bzw. des viralen Gens werden in jeden Lauf eingeschlossen.

Genotypisierungs- und Methylierungsergebnisse werden in Bezug auf Sensitivität und Spezifität mit histologischen Ergebnissen und Nachsorgeergebnissen bei HPV-positiven Frauen mit und ohne klinisch bedeutsame zervikale Erkrankung, die innerhalb eines zweijährigen Nachbeobachtungszeitraums diagnostiziert wurde, korreliert.

Rolle jeder an der Studie beteiligten Einheit und Zeitplan Im ersten Jahr der Studie wird ISPO Frauen auswählen und randomisieren, die Studiendatenbank und die Computervalidierung der Software einrichten. Die Kartons und alle Materialien für den Versand von Selbstprobenahmegeräten werden vorbereitet.

Jedes Screening-Zentrum wird Frauen einladen, die Box mit dem Gerät zur Selbstprobenahme versenden, das Gerät zur Selbstprobenahme von den eingeladenen Frauen entgegennehmen, sie in der Datenbank registrieren und die Proben an die ISPO senden. ISPO L.R.P.O (Regional Oncological Prevention Laboratory) führt hr-HPV-Tests durch und sendet die Ergebnisse an jedes Screening-Zentrum. Jedes Screening-Zentrum erhält die hr-HPV-Ergebnisse von der ISPO und sendet sie an die Frau. Bei positiven HPV-Ergebnissen kontaktiert das örtliche Screening-Zentrum die Frau telefonisch zur kolposkopischen Beurteilung, führt eine Kolposkopie und alle weiteren Nachsorgeuntersuchungen durch, erfasst die Ergebnisse und Fragebogendaten in der Datenbank und beteiligt sich an der Auswertung der Ergebnisse.

Im zweiten Jahr wird die ISPO die Möglichkeit prüfen, die Selbstprobenahme unter Verwendung von Apotheken zu verteilen und Frauen zu diesem Zweck einzuladen, die einen hr-HPV-Test für ansprechende Frauen durchführen. ISPO wird auch HPV-Typisierungs- und Methylierungsprofile erstellen, alle Daten in der Datenbank der Studie erfassen, statistische Analysen durchführen und die Ergebnisse auswerten.