Muestreo autorecopilado en no asistentes Detección de cáncer de cuello uterino: prueba de ADN y triaje molecular para mujeres con VPH positivo

El estudio se llevará a cabo en la región de Toscana e incluirá tres programas de detección organizados: Florencia, Viareggio y Carrara. En estas áreas, los programas de detección cervical invitan activamente a toda la población femenina residente de 34 a 64 años para la prueba del VPH (Virus del Papiloma Humano) como prueba de detección primaria (Florencia y Viareggio), de acuerdo con el nuevo protocolo para la detección del cáncer de cuello uterino en la región de Toscana, o Papanicolaou cada 3 años (Carrara). Las mujeres de 34 a 64 años que habían sido invitadas por el programa de detección en la ronda anterior de detección y no respondieron durante al menos 3 años serán elegibles para el retiro por correo.

En los 3 programas de cribado involucrados, cada año se invita a participar en el programa de cribado a unas 63.000 personas de la clase de edad de 34 a 64 años y alrededor del 40 % de las mujeres no respondieron a la invitación del programa. De ellas, 8000 mujeres elegibles seleccionadas consecutivamente de las listas se distribuirán aleatoriamente en dos grupos. El objetivo es evaluar la tasa de respuesta a la invitación a una muestra vaginal-cervical autoobtenida para la prueba de infección por VPH-AR en comparación con la carta de recordatorio escrita estándar. La aleatorización será realizada centralmente por el centro coordinador (ISPO) utilizando números aleatorios generados por computadora. En el primer año, se invitará a participar en el estudio a una muestra aleatoria de 4000 mujeres elegibles de los 4 programas de detección mediante el envío de automuestras a domicilio. En el brazo de control, las mujeres recibirán el retiro habitual con una nueva carta de invitación con una cita prefijada (se puede mover con una llamada telefónica) para realizar la prueba de detección del VPH en los distritos o clínicas locales. En el brazo de intervención seleccionado para recibir el automuestreo en el hogar, los investigadores asignarán aleatoriamente a las mujeres a 2 dispositivos de automuestreo diferentes que difieren en tener o no un tampón conservante.

Por lo tanto, el grupo de mujeres asignadas en el brazo de intervención (4000) se volverá a asignar al azar 1:1 para recibir el dispositivo S-wet o S-dry.

Suponiendo que el cumplimiento del método tradicional con una carta de invitación es igual al 15 % (Giorgi Rossi 2010), el presente estudio está diseñado para poder detectar una diferencia absoluta del 1,5 % o más en la tasa de asistencia con niveles convencionales de poder (80%) y significación (95%, prueba de un lado) con un tamaño de muestra planificado de 8000 mujeres. Suponiendo un tamaño de muestra igual a 2000 mujeres para cada dispositivo de muestreo, una diferencia significativa igual o superior a 4,0 puntos porcentuales más o menos, considerando una tasa de VPH positivo de alrededor del 21% (Giorgi Rossi 2010) con el mismo poder y significancia.

El estudio será sometido, antes de su inicio, para su aprobación a los Comités de Ética Local del Centro Coordinador y del Área Vasta. Cada mujer en los grupos de estudio recibirá una carta de alerta explicando que el Programa de detección pública local le proporcionará una caja que contiene un dispositivo de automuestreo completamente gratis para realizar la prueba de detección del VPH directamente en su hogar. Después de 1 semana, cada programa de detección involucrado en el estudio enviará por correo ordinario a la casa de las mujeres asignadas al azar una carta de invitación para participar en el programa de detección del VPH y una caja con: dispositivo de muestreo de automuestra, un folleto de detección del VPH en uso en el Programa Región Toscana. Información relacionada con el estudio, instrucciones para realizar el automuestreo, etiquetas preimpresas para poner en el tubo, el formulario de consentimiento informado para firmar, el cuestionario y un sobre prefranqueado para devolver el kit de automuestreo. Los cuestionarios se enviarán con un dispositivo de automuestreo que incluya elementos relacionados con: fecha de la última prueba de Papanicolaou de la mujer, preguntas sobre el desempeño del automuestreo (dolor, vergüenza, factibilidad), lo que más se apreció en el automuestreo (hacerlo por ellos mismos, privacidad, ausencia de médico, ausencia de espéculo) y lo que no les gustó de la auto-toma de muestras (dolor, el dispositivo, la instrucción). Toda la información se recopilará utilizando escalas ordinales de 5 puntos sobre la aceptabilidad general. Las mujeres que decidan participar en el estudio pueden enviar directamente por correo ordinario al programa local de tamizaje el sobre prefranqueado con la autotoma, el cuestionario y el consentimiento informado firmado (que incluirá también la autorización para contacto telefónico). En el segundo año de estudio en la ciudad de Florencia, los investigadores también evaluarán la posibilidad de involucrar a las farmacias en la distribución de la automuestra. En este caso, se invitará por carta a 500 mujeres seleccionadas al azar para que se realicen la automuestra para la prueba de detección del VPH y recojan el dispositivo en la farmacia. Una lista de las farmacias que aceptaron ser incluidas en el estudio estará disponible en la carta de invitación. Se evaluará el impacto en el cumplimiento y satisfacción de las mujeres. Todos los análisis de VPH y las pruebas moleculares se realizarán en el Laboratorio Molecular de ISPO, el laboratorio central para la prueba de detección de VPH en la región de Toscana.

Prueba ADN cobas4800 VPH:

El VPH se evaluará con la misma prueba de VPH utilizada en las pruebas de detección regulares: la prueba Cobas 4800 HPV (Roche Diagnostics) es una prueba cualitativa in vitro que utiliza la amplificación del ADN objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real para la detección de 14 tipos de VPH de alto riesgo (AR) en un solo análisis. Es un ensayo multiplex cualitativo que proporciona información de genotipificación específica para los tipos de VPH 16 y 18, al mismo tiempo que detecta los otros 12 tipos de VPH de alto riesgo (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) como resultado conjunto. La ß-globina de entrada celular se utiliza como control interno para evaluar la calidad de la muestra. La prueba se está realizando en el Sistema cobas 4800 completamente automatizado (Roche Diagnostics), según las instrucciones del fabricante; una muestra se considera positiva según el algoritmo específico del software del sistema Cobas.

Gestión de mujeres inscritas Las mujeres VPH negativas recibirán en casa los resultados de la prueba de detección y se les volverá a invitar después de 5 años de acuerdo con el protocolo de detección de VPH. Todas las mujeres que resultaron VPH positivas serán contactadas por teléfono para realizar una colposcopia y una consejería sobre el VPH y el riesgo de cáncer de cuello uterino. Si la colposcopia es positiva, se tomará una biopsia y se seguirá a cada mujer de acuerdo con el protocolo del programa de detección de VPH en la Toscana. Si la colposcopia resulta negativa, se volverá a invitar a las mujeres a someterse a un control con la prueba del VPH dentro de un año. Durante la colposcopia también se realizará una prueba de Papanicolaou para orientar el seguimiento post colposcópico de acuerdo con el protocolo aprobado en la Región Toscana. Si una mujer con VPH-ar no asistía, se intentaba contactarla nuevamente por teléfono y luego también por carta.

Triaje molecular de mujeres VPH positivas

Genotipificación del VPH:

Se realizará un genotipado específico en todas las muestras positivas para hrHPV. El ADN extraído será genotipado. En todas las muestras autorecogidas positivas para VPH, los investigadores realizarán análisis de metilación cuantitativos para obtener una cuantificación del estado de metilación de las CpG investigadas, utilizando ADN extraído para el genotipado. Los investigadores evaluarán la metilación de las islas CpG dentro de las regiones promotoras de genes y microARN como CADM1 (molécula de adhesión celular 1), MAL (proteína de mielina y linfocitos) y hsa-miR-124 y el estado de metilación de las regiones L1 y L2 del VPH. . Los investigadores investigarán para cada tipo los CpG ubicados cerca de la posición de secuencia de los CpG de HPV16 que se han destacado como asociados con un mayor riesgo de enfermedad neoplásica intraepitelial cervical (CIN2+): posiciones de nucleótidos L1 5601-5616 y 6457; Posición del nucleótido L2 4261.

Modificación con bisulfito: las muestras de ADN genómico se modificarán con bisulfito utilizando el kit comercial EpiTect Bisulfite (QIAGEN). El ADN genómico modificado con bisulfito se utilizará inmediatamente para la pirosecuenciación o se almacenará a -80 °C.

Se incluirán controles de ADN humano sintético metilado y no metilado para genes humanos y ADN de la línea celular CaSki o un control de ADN de HPV16 de la OMS (Organización Mundial de la Salud) para genes virales en cada conjunto de modificaciones para comprobar la eficacia de la modificación.

Estado de metilación: el estado de metilación en los genes seleccionados se evaluará en el ADN modificado con bisulfito. Los ensayos se realizarán empleando cebadores seleccionados de acuerdo con las secuencias publicadas (Hesselink AT et al. Mirabello L et al, Wentzensen N et al). Cuando no esté disponible, los cebadores se diseñarán utilizando un software específico. Se establecerán enlaces con los bancos de genes disponibles para las referencias de secuencias de genes. Se realizará una reacción de PCR preliminar en un volumen total de 35 microL que contiene 1X KCl, 2 mM MgCl2, 200 microM dNTP, 0,5 microM de cada cebador (antisentido biotinilado), 1,75 U Taq polimerasa y 6 microL de ADN modificado con el perfil de termociclado adecuado. La amplificación y la medición en tiempo real se realizaron en el sistema 7500 ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). En cada ejecución se incluirán controles modificados con bisulfito para el estado metilado y no metilado de la célula y el gen viral, respectivamente.

Los resultados de genotipado y metilación se correlacionarán en términos de sensibilidad y especificidad con el resultado histológico y los resultados de seguimiento en mujeres VPH positivas con y sin enfermedad cervical clínicamente significativa diagnosticada dentro de un período de seguimiento de dos años.

Rol de cada Unidad involucrada en el estudio y calendario En el primer año del estudio, ISPO seleccionará y aleatorizará a las mujeres, establecerá la base de datos del estudio y la validación informática del software. Se prepararán las cajas y todo el material para el envío por correo de los dispositivos de automuestreo.

Cada centro de detección invitará a las mujeres, enviará la caja con el dispositivo de automuestreo, recibirá el dispositivo de automuestreo de las mujeres invitadas, las registrará en la base de datos y enviará las muestras a ISPO. ISPO L.R.P.O (Laboratorio Regional de Prevención Oncológica) realizará la prueba de hr-HPV y enviará los resultados a cada centro de detección. Cada centro de detección recibirá los resultados de hr-HPV de ISPO y se los enviará a la mujer. En caso de resultados positivos de VPH, el centro de detección local se comunicará con la mujer por teléfono para una evaluación colposcópica, realizará una colposcopia y todas las visitas de seguimiento posteriores, registrará los resultados y los datos de los cuestionarios en la base de datos y participará en la evaluación de los resultados.

En el segundo año, ISPO evaluará la factibilidad de distribuir la automuestra utilizando farmacias e invitó a mujeres para este fin a realizar la prueba de VPH de alto riesgo para las mujeres que respondieron. ISPO también realizará perfiles de tipificación y metilación del VPH, registrará todos los datos en la base de datos del estudio, realizará análisis estadísticos y evaluará los resultados.