Amostragem autocoletada em triagem de câncer cervical não participante: teste de DNA e triagem molecular para mulheres com HPV positivo

O estudo será realizado na região da Toscana, incluindo três programas de triagem organizados: Florença, Viareggio e Carrara. Nessas áreas, os programas de triagem cervical convidam ativamente toda a população feminina residente com idade entre 34 e 64 anos para o teste de HPV (vírus do papiloma humano) como teste de triagem primária (Florença e Viareggio), de acordo com o novo protocolo para triagem de câncer cervical na região da Toscana, ou Papanicolau a cada 3 anos (Carrara). Mulheres com idades entre 34 e 64 anos que foram convidadas pelo programa de triagem na rodada anterior de triagem e não responderam por pelo menos 3 anos serão elegíveis para devolução por correspondência.

Nos 3 programas de rastreio envolvidos, todos os anos cerca de 63.000 na faixa etária dos 34-64 anos são convidados a participar no programa de rastreio e cerca de 40% das mulheres não respondem ao convite do programa. Dessas, 8.000 mulheres elegíveis selecionadas consecutivamente nas listas serão randomizadas em dois grupos. O objetivo é avaliar a taxa de resposta ao convite para uma amostra vaginal-cervical auto-obtida para teste de infecção por hr-HPV em comparação com a carta de lembrete escrita padrão. A randomização será realizada centralmente pelo centro coordenador (ISPO) usando números aleatórios gerados por computador. No primeiro ano, uma amostra aleatória de 4.000 mulheres elegíveis dos 4 programas de triagem será convidada a participar do estudo, enviando uma autoamostragem em casa. No braço de controle, as mulheres receberão o retorno habitual com uma nova carta de convite com um compromisso pré-agendado (pode ser movido com um telefonema) para realizar o teste de rastreamento de HPV nos distritos locais ou na clínica. No braço de intervenção selecionado para receber a auto-amostragem em casa, os investigadores irão alocar aleatoriamente as mulheres para 2 diferentes dispositivos de auto-amostragem, diferindo em ter ou não um tampão conservante.

Portanto, o grupo de mulheres alocado no braço de intervenção (4.000) será randomizado 1:1 para receber o dispositivo S-wet ou S-dry.

Assumindo que a adesão ao método tradicional com carta-convite é igual a 15% (Giorgi Rossi 2010), o presente estudo é projetado para ser capaz de detectar uma diferença absoluta de 1,5% ou mais na taxa de atendimento com níveis convencionais de poder (80%) e significância (95%, teste de um lado) com um tamanho de amostra planejado de 8.000 mulheres. Assumindo um tamanho de amostra igual a 2.000 mulheres para cada dispositivo de amostragem, uma diferença significativa igual ou superior a 4,0 pontos percentuais para mais ou para menos, considerando uma taxa positiva de HPV de cerca de 21% (Giorgi Rossi 2010) com o mesmo poder e significância.

O estudo será submetido, antes de iniciar, à aprovação dos Comitês de Ética Locais do Centro Coordenador e da Área Vasta. Cada mulher nos grupos de estudo receberá uma carta de alerta explicando que o Programa de Triagem Pública local forneceria a ela uma caixa contendo um dispositivo de autoamostragem totalmente gratuito para realizar o teste de triagem de HPV diretamente em casa. Após 1 semana, cada programa de triagem envolvido no estudo enviará por correio regular para casa das mulheres randomizadas uma carta de convite para participar do programa de triagem de HPV e uma caixa com: dispositivo de amostragem de auto-amostra, um folheto de triagem de HPV em uso no Programa Região da Toscana. Informações relacionadas ao estudo, instruções para realizar a autoamostragem, rótulos pré-impressos para colocar no tubo, o termo de consentimento informado para assinar, o questionário e um envelope pré-selado para devolução do kit de autoamostragem. Os questionários serão enviados com dispositivo de auto-amostragem incluindo itens relacionados a: data do último exame de Papanicolaou da mulher, questões sobre o desempenho da auto-amostragem (dor, constrangimento, viabilidade), o que foi mais apreciado na auto-amostragem (fazê-lo por si mesmos, privacidade, ausência de médico, ausência de espéculo) e o que não gostaram em relação à auto-amostragem (dor, o aparelho, a instrução). Todas as informações serão coletadas usando escalas ordinais de 5 pontos na aceitabilidade geral. As mulheres que decidirem participar do estudo podem enviar diretamente por correio ao programa de triagem local o envelope pré-selado com a autoamostragem, o questionário e o consentimento informado assinado (que também incluirá a autorização para contato telefônico). No segundo ano de estudo na cidade de Florença, os pesquisadores também avaliarão a possibilidade de envolver as Drogarias na distribuição de auto-amostragem. Neste caso, 500 mulheres randomizadas serão convidadas por carta para realizar auto-amostragem para teste de rastreamento de HPV coletando o aparelho na farmácia. A lista das farmácias que concordaram em participar do estudo estará disponível na carta convite. Será avaliado o impacto na adesão e satisfação das mulheres. Todas as análises de HPV e testes moleculares serão realizados no Laboratório Molecular do ISPO, o laboratório central para teste de triagem de HPV na região da Toscana

Teste de DNA cobas4800 HPV:

O HPV será avaliado com o mesmo teste de HPV usado na triagem regular: o teste Cobas 4800 HPV (Roche Diagnostics) é um teste qualitativo in vitro que utiliza a amplificação do DNA alvo por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real para a detecção de 14 tipos de HPV de alto risco (HR) em uma única análise. É um ensaio multiplex qualitativo que fornece informações de genotipagem específicas para os tipos 16 e 18 do HPV, enquanto detecta simultaneamente os outros 12 tipos de HPV de alto risco (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68) como um resultado combinado. A ß-globina da entrada celular é usada como um controle interno para avaliar a qualidade da amostra. O teste está sendo realizado no sistema cobas 4800 totalmente automatizado (Roche Diagnostics), de acordo com as instruções do fabricante; uma amostra é considerada positiva de acordo com o algoritmo específico do software do sistema Cobas.

Manejo das mulheres inscritas As mulheres HPV negativas receberão em casa os resultados do teste de triagem e serão convidadas novamente após 5 anos de acordo com o protocolo de triagem de HPV. Todas as mulheres que resultaram em HPV positivo serão contatadas por telefone para realizar colposcopia e aconselhamento sobre HPV e risco de câncer cervical. Se a colposcopia for positiva, uma biópsia será realizada e cada mulher será acompanhada de acordo com o protocolo do programa de triagem de HPV na Toscana. Se a colposcopia for negativa, as mulheres serão novamente convidadas a fazer o controle com o teste de HPV dentro de um ano. Durante a colposcopia também será feito um teste de Papanicolau para orientar o acompanhamento pós-colposcópico de acordo com o protocolo aprovado na região da Toscana. Se uma mulher com hr-HPV não comparecesse, esforços eram feitos para contatá-la novamente por telefone e também por carta.

Triagem Molecular de Mulheres HPV Positivas

Genotipagem do HPV:

A genotipagem específica será realizada em todas as amostras positivas para hrHPV. O DNA extraído será genotipado. Em todas as amostras autocoletadas positivas para HPV, os investigadores realizarão análises quantitativas de metilação para obter uma quantificação do status de metilação dos CpGs investigados, usando DNA extraído para genotipagem. Os investigadores avaliarão a metilação das ilhas CpG nas regiões promotoras de genes e microRNAs, como CADM1 (Molécula de adesão celular 1), MAL (Mielina e proteína de linfócitos) e hsa-miR-124- e o estado de metilação das regiões de HPV L1 e L2 . Os investigadores investigarão para cada tipo os CpGs localizados próximos à posição da sequência de CpGs do HPV16 que foram destacados como associados a um risco aumentado de doença neoplásica intraepitelial cervical (CIN2+): posições de nucleotídeo L1 5601-5616 e 6457; Posição do nucleotídeo L2 4261.

Modificação de bissulfito: As amostras de DNA genômico serão submetidas à modificação de bissulfito usando o kit comercial EpiTect Bisulfite (QIAGEN). O DNA genômico modificado por bissulfito será utilizado imediatamente para pirosequenciamento ou armazenado a -80°C.

Controles de DNA humano sintético metilado e não metilado para genes humanos e DNA da linha celular CaSki ou um controle de DNA HPV16 da OMS (Organização Mundial da Saúde) para genes virais serão incluídos em cada conjunto de modificação para verificar a eficiência da modificação.

Status de metilação: O status de metilação nos genes selecionados será avaliado no DNA modificado por bissulfito. Os ensaios serão realizados empregando primers selecionados de acordo com sequências publicadas (Hesselink AT et al. Mirabello L et al, Wentzensen N et al). Quando não disponíveis, os primers serão projetados usando um software específico. Links com bancos de genes disponíveis serão configurados para referências de sequências de genes. Uma reação de PCR preliminar será realizada em um volume total de 35 microL contendo 1X KCl, 2mM MgCl2 , 200 microM dNTPs, 0,5 microM de cada primer (antisense biotinilado), 1,75U Taq polimerase e 6 microL de DNA modificado com o perfil de termociclagem adequado. A amplificação e medição em tempo real foram realizadas no sistema 7500 ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Controles modificados por bissulfito para status metilado e não metilado da célula e do gene viral, respectivamente, serão incluídos em cada corrida.

Os resultados de genotipagem e metilação serão correlacionados em termos de sensibilidade e especificidade ao resultado histológico e resultados de acompanhamento em mulheres HPV positivas com e sem doença cervical clinicamente significativa diagnosticada dentro de um período de acompanhamento de dois anos.

Papel de cada Unidade envolvida no estudo e cronograma No primeiro ano do estudo, a ISPO selecionará e randomizará as mulheres, configurará o banco de dados do estudo e a validação do software por computador. As caixas e todos os materiais para envio de dispositivos de auto-amostragem serão preparados.

Cada centro de triagem convidará as mulheres, enviará a caixa com o dispositivo de auto-amostragem, receberá o dispositivo de auto-amostragem das mulheres convidadas, cadastra-as no banco de dados, enviará as amostras para a ISPO. O ISPO L.R.P.O (Laboratório Regional de Prevenção Oncológica) realizará o teste de hr-HPV e enviará os resultados para cada centro de triagem. Cada centro de triagem receberá os resultados de hr-HPV do ISPO e os enviará à mulher. Em caso de resultado positivo para HPV, o centro de triagem local entrará em contato com a mulher por telefone para avaliação colposcópica, realizará colposcopia e todas as consultas de acompanhamento, registrará os resultados e os dados dos questionários no banco de dados e participará da avaliação dos resultados.

No segundo ano, a ISPO avaliará a viabilidade de distribuir a auto-amostragem usando farmácias e convidará as mulheres para esse fim, realizando o teste de hr-HPV para as mulheres respondentes. A ISPO realizará também perfis de metilação e tipagem de HPV, registrará todos os dados no banco de dados do estudo, realizará análises estatísticas e avaliação dos resultados.