Role adheze monocytů a vaskulárních lézí v úspěchu nebo selhání cévního přístupu u uremických pacientů (ROMAVAS)

Cíle výzkumného projektu

Pro pacienty s progresivním chronickým onemocněním ledvin je definitivní léčbou renální substituční terapie. Jednou z metod je hemodialýza, která je často volena u pacientů nad 65 let. věku. Několik doporučení pro klinickou praxi doporučuje arteriovenózní píštěl (AVF) spíše než centrální žilní katétr nebo arteriovenózní štěp jako preferovaný přístup k léčbě udržovací hemodialýzou (HD). Navzdory snahám zlepšit umístění AVF jak u hemodialyzačních incidentů, tak u převládající populace, mnoho pacientů pokračuje v dialýze přes centrální žilní katétr, což je vystavuje vyššímu riziku infekce, komorbidity a mortality ve srovnání s použitím AVF pro HD. Kromě toho je míra primárního selhání AVF v publikovaných sériích údajně tak vysoká, 20–50 %, což potvrzuje, že ultrazvuk nemůže dostatečně informovat lékaře, aby přesně předpověděl úspěch nebo selhání. Vzhledem k vyššímu riziku časného selhání AVF je nabízení tohoto typu přístupu sporné u diabetiků, nepříznivého průměru tepny/žily a starších lidí. K provedení hemodialýzy je nutný cévní přístup zajišťující dostatečný průtok krve. Takový přístup se nejčastěji získá vytvořením cévního spojení mezi tepnou a žílou na horní končetině. Nedávná data z evropských a národních registrů jasně naznačují obrovský nárůst incidentních dialyzovaných pacientů nad 65 let. U starších pacientů s mnoha komorbiditami a omezeným prediktivním přežitím by mělo být opatrné rozhodování, zda zahájit dialýzu, kdy a jak. Při volbě cévního přístupu je třeba vzít v úvahu problém s nedozráváním píštěle. Úspěšné vytvoření trvalého cévního přístupu závisí na zdraví cévy, charakteristikách pacienta a případně genetických faktorech. U pacientů s terminálním onemocněním ledvin jsou cirkulující monocyty aktivovány a prozánětlivé monocyty jsou expandovány. Nedávné údaje naznačují, že uremické stavy vedou monocyty k diferenciaci a interakci s arteriální stěnou podporující aterosklerózu. Tuto interakci lze laboratorně studovat testováním zánětlivé aktivity THP-1 monocytů a kontrolou proaterosklerotických a kalcifikačních markerů ve vzorku tepny (odebíráno při tvorbě AVF).

Výzkumná hypotéza: aktivace monocytů a progrese vaskulárních lézí ovlivňují proces remodelace (dozrávání) arteriovenózní píštěle, určuje její použitelnost (funkčnost). Vyšetřovatelé také předpokládají, že zvýšení obsahu kolagenu ve vaskulárním médiu (mediální fibróza) by předoperačně zhoršilo vaskulární dilataci, a tím by omezilo pooperační zvětšení průměru arteriovenózní píštěle, průtok krve a nakonec zrání AVF.

Druhá pracovní hypotéza: metrický věk pacienta s mírnými až středně těžkými vaskulárními lézemi není limitujícím faktorem úspěšnosti AVF a dozrávání.

Hlavním cílem studie je posouzení změn v cévách a aktivaci monocytů a jejich vliv na schopnost tvorby AVF a jeho využitelnost pro hemodialýzu. Sekundárním cílem této studie je provést vylepšené hodnocení arteriálního zdraví před operací a korelovat tato měření s vaskulárními lézemi. Vyšetřovatelé mají v úmyslu provést předoperační vaskulární mapování, průtokově zprostředkovanou dilataci (FMD) a posoudit endoteliální funkci. Tato neinvazivní měření poskytnou přesnější obraz celkového vaskulárního zdraví před vytvořením AVF s konečným záměrem informovat lékaře o pravděpodobnosti úspěchu nebo neúspěchu.

Pracovní plán

Účastníci budou podrobeni důkladnému hodnocení morfologického a funkčního stavu cév horní končetiny technikami uvedenými v metodice studie. Plán studie předpokládá nábor pacientů, u kterých bude provedeno hloubkové posouzení cév horních končetin. Poté bude provedeno vytvoření cévního přístupu - arteriovenózní píštěle pro dialýzu. Při operaci arteriovenózní píštěle budou odebrány vzorky arterií a žil. Jeho zrání bude hodnoceno konvenčním způsobem (funkční píštěl umožňující podání adekvátní dialyzační dávky) i pomocí kritérií uvedených v publikacích.

Návrh studie Prospektivní studie s náborem po sobě jdoucích přibližně 30 pacientů s chronickým onemocněním ledvin stadia 4 nebo 5, kteří budou odesláni k vytvoření cévního přístupu k hemodialýze.

Zahrnuje: (1) ve věku >18 let, (2) trpí chronickým onemocněním ledvin s odhadovanou rychlostí glomerulární filtrace (eGFR) <20 ml/min/1,73 m2 , (3) Prochází tvorbou AVF s venózní end-to-arteriální anastomózou na horní končetině.

Vyloučení: (1) Srdeční selhání funkční třídy III nebo IV podle New York Heart Association a (2) epizoda kardiovaskulární nebo cerebrovaskulární příhody nebo intervenční léčba během 3 měsíců před screeningem. Potřeba jakéhokoli intervenčního postupu (chirurgický zákrok nebo angioplastika) ke korekci okluzivní nebo špatně fungující píštěle.

Po získání informovaného souhlasu s účastí ve studii bude každý účastník testován s dodržovanými opatřeními.

Studijní opatření

Demografické a klinické charakteristiky budou shromážděny během rozhovoru (dlouhověkost rodiny, hospitalizace, anamnéza kanylace žíly) a na základě lékařských záznamů (srdeční příhody včetně angiografických studií, rakovina, diabetes, onemocnění periferních tepen, demence a další přidružená onemocnění. Fyzikální vyšetření zaměřené na srdeční funkce (krevní tlak ve dvou polohách, srdeční frekvenci, městnání při poslechu a hrudníku a dále vyšetření anatomie cév Allenovým testem (průchodnost palmární klenby), přítomnost pulsu, průchodnost žil se stází a bez ní.

Zobrazovací studie

Ultrazvukový stav cévy bude vyhodnocen před vytvořením AVF (průtok v horních ramenech, průměr tepen a žil, možná stenóza atd.) a v období sledování (1., 14., 30. den). Ve vybraných případech (anamnéza předchozí katetrizace podklíčkové žíly, rozvinutá kolaterální cirkulace) bude provedena venografie.

Histomorfologie a imunomorfologie cév

Arteriální a venózní vzorky budou obarveny. Pro imunomorfologické hodnocení budou použity následující markery. Exprese proaterosklerotických molekul (ACE/ACE2, VCAM-1, ICAM-1) v tepně a žíle (1-2mm řez odebraný během operace), které podléhají okamžitému zmrazení. Massonovo trichromové barvení vzorků bude použito ke kvantifikaci mediální fibrózy (kolagenu) jak tepny, tak žíly.

Parametry plné krve pro cirkulující molekuly/buňky

Vzorky krve budou odebrány při rutinní kontrole nebo před rutinní dialýzou u HD pacientů (odkaz na umístění AVF). Vzorky budou odebrány a uloženy před AVF. Následující vaskulární biomarkery budou hodnoceny pomocí enzymatických imunoanalýz: ADMA a sICAM1, sVCAM1. Pro polymorfismus genu HO-1 bude odebrán vzorek krve. Bude vyhodnocena pomocí Real Time PCR (zmrazené vzorky DNA).

Leukocytární RNA, sérum a izolace primárních lidských monocytů

Vzorky krve pro izolaci RNA a séra budou získány od pacientů s ESRD/HD. Vzorky krve pro izolaci leukocytové RNA budou odebrány do zkumavek Tempus Blood RNA (Life Technologies). Celková RNA se izoluje pomocí souprav Tempus Spin RNA Isolation Kit podle pokynů výrobce (Life Technologies). Budou hodnoceny transkripty genů souvisejících s procesy kalcifikace (osteopontin, osteokalcin, RunX2), zánětem (TNFa, IL6) a aterosklerózou (ACE/ACE2, VCAM-1, ICAM-1).

Adhezní a transmigrační testy

Další in vitro test je určen pro adhezi/invazi THP-1 monocytů. Bude testovat agresivní vlastnosti endotelu infiltrace monocytů. Bude provedena adheze THP-1 monocytů k endoteliálním monovrstvám HUVEC a všechny transmigrační testy.

Cévní funkční testy

K posouzení vaskulární funkce (a predikci kardiovaskulárního rizika) je k dispozici řada opatření, jako je dilatace zprostředkovaná průtokem (FMD) nebo špičkový průtok krve (PBF) brachiální arterie. FMD poskytuje hodnocení funkce makrovaskulárních endoteliálních buněk. Zdravý endotel uvolňuje silný vazodilatátor (oxid dusnatý, NO) v reakci na ischemický stres, jako je okluze brachiální tepny manžetou. FMD je měřítkem změny průměru brachiální tepny v reakci na okluzi manžety a následné uvolnění NO. Zatímco slintavka a kulhavka odráží schopnost velké tepny vazodilatovat, následná změna krevního toku, která následuje, představuje zdraví periferních odporových cév nebo mikrovaskulární funkci.

K posouzení endoteliální dysfunkce budou provedeny výše uvedené vaskulární testy. Absolutní zvětšení průměru po ischemii (BAD, průměr brachiální arterie), maximální průtok krve (PBF) a průtokem zprostředkovaná dilatace (FMD) bude provedeno na obou pažích v den 0 (před vytvořením AVF) a poté v den 1, 14-28 (naproti rameni AVF). Měření bude provedeno podle publikovaného standardního protokolu pro měření FMD pomocí přístroje Aloka alpha 7 USG s Dopplerovou lineární sondou.

Rutinní laboratorní parametry odebrané na začátku a během sledování (14-28, 56-60, 90 dní): Kompletní krevní obraz se zaměřením na poměr neutrofilů a lymfocytů (NLR), fosfor, vápník, PTH, C-reaktivní protein (CRP ), kyselina močovina, lipidy (cholesterolové frakce, triglyceridy).

Statistická analýza

Všechna data účastníků z náboru a sledování budou shromažďována ve speciálně navrženém počítačovém programu. Primárním výsledkem této studie je úspěch AVF (patentovaný a zralý) 8 a 14 týdnů po vytvoření. Základní charakteristiky pacientů včetně věku, pohlaví a komorbidit budou porovnány mezi pacienty s úspěšnou AVF a pacienty s neúspěšnou AVF. Kategorické proměnné budou prezentovány pomocí frekvence (procenta) a porovnání budou provedena pomocí Chi-kvadrát nebo Fisherova exaktního testu. Základní distribuce spojitých proměnných budou testovány na normalitu pomocí Shapiro-Wilkova testu a poté analyzovány vhodnými testy. Veškeré analýzy budou provedeny externí statistickou laboratoří s vysokými referencemi. Plánuje se odborná statistická expertíza (laboratoř PREEST na Matematickém institutu ve Wroclawi) s využitím R balíčku a softwaru STATISTICA 10.