直接抗ウイルス剤（DAA）療法に対する無反応における宿主免疫の役割

研究の目的と仮説 プロジェクトの根底にある仮説は、慢性HCV感染における抗ウイルス免疫機能不全のレベルが、治療に対する無反応に影響を与える可能性がある原因因子であるということです。 ただし、DAA 療法を開始する前にナイーブな慢性 HCV 患者によって発現される個々の抗ウイルス T 細胞応答の特徴に関する情報は、治療のその後の結果と、感染を制御できない場合の影響の可能性に関連して利用できません。 慢性 HCV 感染症における抗 HCV 免疫応答に関する利用可能な結果は、DAA レジメンで治療された患者で得られたものであり、結果に応じた評価なしでは現在のガイドラインには含まれていません。 したがって、本研究の目的は、レスポンダー患者とノンレスポンダー患者の 2 つのグループにおける個々の HCV 特異的 T 細胞応答を比較することにより、治療に対する非応答がより広範で深い抗ウイルス免疫機能障害と関連しているかどうかを理解することです。 DAA 療法に応答しないことに関連する T 細胞応答の欠陥の可能性は、効果のない治療サイクルの終了後に非応答患者の免疫学的背景を特徴付けることができるように、効果のない治療によって実質的に変更されるべきではないという仮定が立てられています。結果を、後にウイルスを除去したナイーブでウイルス血症の患者のベースライン前治療反応と比較します。 非応答者患者の治療前分析でも、十分な数の非応答者患者を特定するために膨大な数のナイーブ患者を登録する必要があり、研究は実行不可能で非常に長くなります. この戦略により、ベースラインで登録されたほとんどの患者がレスポンダーであると予想される一方で、治療の終了後および6〜12か月の適切なウォッシュアウト期間の後に研究される非レスポンダー患者であるため、採用は非常に迅速になります。再治療の開始は、協力センターですでに特定されており、プロトコルが承認され次第、すぐに研究に利用できるようになります。 結果に基づいて、将来の分析の可能な目的は、非レスポンダー患者のT細胞機能障害を分子レベルでさらに特徴付けて、それらの修正が効率的な抗ウイルスを誘導/回復するための実行可能なアプローチを表すことができるかどうか、およびどの戦略によって表すことができるかを定義することです。 -前世代のDAAの効果を補完および強化するためのウイルス反応。 最後に、非応答患者における防御免疫の特徴付けにより、毎日の臨床診療で使用される治療に対する非応答のベースライン予測因子を特定できる可能性があります。

研究の背景 IFN を含まない DAA で治療されたナイーブな非肝硬変患者における持続ウイルス反応 (SVR) の割合は 95% から 100% の間ですが、遺伝子型 3 の肝硬変患者および感染遺伝子型に関係なく、非代償性肝硬変。 DAA ベースの治療の高い有効性は、実際のコホートで確認されており、登録研究よりもわずかに低い SVR 率を示しています。 DAA 療法の失敗率は非常に限られていますが (約 5%)、治療を必要とする慢性 HCV 感染患者の数が多いため、応答しない患者の総数は多いと予想されます。 治療の失敗は最も頻繁に再発をもたらし、治療中のウイルスのブレークスルーはそれほど頻繁ではありません. 耐性変異の出現、不正確な遺伝子型の定義による最適でない治療、進行した肝疾患など、さまざまな要因が治療に反応しないことに関与していると考えられています。

治療の失敗を決定する際のベースラインRAVの役割はまだ議論されており、ベースライン耐性試験は臨床的有用性が限られているようです. 代わりに、DAAベースのレジメン中のRAVの出現と、ウイルス学的失敗の決定におけるその役割は十分に文書化されています。 薬剤耐性変異体が無反応患者の大部分で検出されたとしても、治療効果を損なうそれらの役割は完全には明らかではありません。

HCVジェノタイピングのための現在利用可能な第2世代の商用アッセイの使用により、遺伝子型の誤分類のリスクが減少しましたが、臨床診療で適用される方法の感度を下回る異なる遺伝子型/サブタイプの割合による混合感染の可能性は依然としてあります.最適でない治療による治療に反応しない原因。

しかし、耐性株の出現と、遺伝子型の検出が正しくないことによる次善の治療は、治療失敗例の一部しか説明できず、宿主関連の要因、特に抗ウイルス免疫応答が役割を果たす可能性があります。 実際、自然免疫応答および適応免疫応答は、慢性 HCV 感染で大きく損なわれることが知られていますが、バックグラウンド免疫応答が DAA 治療の最終結果に与える可能性のある寄与については、非常に限られた情報しか入手できません。 PegIFN ベースの治療とは対照的に、DAA 治療を受けた患者を対象とした最近の研究では、HCV 特異的 CD8 細胞の頻度と機能が IFN を使用しない治療下で増加し、消耗した表現型が部分的に逆転することが示されています。 さらに、DAA療法は、慢性HCV患者に典型的なNK細胞活性化表現型を修正するNK細胞コンパートメントを調節することができます。 したがって、抗ウイルス免疫のベースライン障害のレベルは、ベースラインの免疫抑制がより深く、より広くなると、DAA治療に対する耐性の可能性が高くなり、治療後の免疫回復の可能性に影響を与える可能性があります. この仮説はテストする必要があります。

主要エンドポイント 研究の目的は、非応答者（検出可能なものを含むものと含まないもの）の患者における全体的なHCV特異的T細胞応答の強度（抗ウイルス機能の合計レベル）と質（多特異性および多機能性）を比較することです。耐性関連バリアント - RAVs) および DAA 療法へのレスポンダー。 この目標を達成するために、サイトカイン産生 (IL2、IFN- g および TNF-a) および細胞毒性の可能性 (CD107 脱顆粒)。

• 主要なエンドポイントとして、T 細胞応答の全体的な強度は、レスポンダー患者と非レスポンダー患者で評価されます。個々のT細胞反応性の総強度は、個々のレスポンダーおよび非レスポンダー患者ごとに、分析されたさまざまなT細胞パラメーター（総CD3細胞およびCD4 / CD8サブセットで検出されるサイトカイン産生および細胞毒性）を合計することによって定義されます。結果の値は、患者の 2 つのグループで比較されます。
• 分析の第 2 レベルでは、個々の機能の発現を個別に比較することにより、HCV 特異的 T 細胞応答の多機能性および多特異性に関して、レスポンダー患者と非レスポンダー患者の間の T 細胞反応性の質的差異を評価します。 (IL2、IFN-g、TNF-a) および 2 つの患者群における T 細胞応答を誘導する個々の HCV タンパク質の能力。

HCV 特異的 T 細胞応答の特徴付け。

1. 構造的および非構造的 HCV タンパク質に対する CD4+ および CD8+ の全体的な反応性を分析するために、HCV (遺伝子型 1) 配列全体をカバーする重複 15-mer ペプチドの包括的なパネルが使用されます。 T細胞応答は、IFN-g、IL-2、およびTNF-aについて、および脱顆粒（CD107のアップレギュレーション）について、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色（ICS）によって分析されます（ペプチド刺激の10日後）。 IFN-g ex-vivo の Elispot (短期間のペプチド刺激後); HLA クラス I およびクラス II 制限特異性を持ち、HCV とは無関係のさまざまなウイルスおよび病原体 (CMV、EBV、FLU) に対する CD8+ および CD4+ 応答の標的であることが知られている合成ペプチドエピトープをコントロールとして使用します。
2. CD8+ T 細胞の反応性をさらに分析するために、HCV の最も広く認識されている HLA-A2 制限エピトープのいくつかを含む HLA-A2/ペプチド デキストラマーを HLA-A2+ 患者に使用して、循環ウイルス特異的 CD8+ 細胞を定量化し、増殖能を測定します。 ex-vivo とペプチド刺激の 10 日後のデキストラマー陽性 CD8+ 細胞頻度の比較。
3. 耐性変異の出現を示す非レスポンダー患者では、バリアント配列に対応する特定のペプチドが合成され、出現する変異がHCV特異的T細胞の活性化と機能に影響を与える可能性があるかどうかを分析するために使用されます。 この目的のために、プロトタイプおよびバリアント ペプチドの異なる T 細胞機能に対する刺激効果 (サイトカイン産生、細胞毒性、増殖能) を比較します。

二次エンドポイント

1. ウイルス感染の制御と T 細胞応答の調節に関連することが知られている追加の免疫集団と血清因子の分析。

   • ナチュラル キラー (NK) 細胞分析: NK 細胞の表現型は、フローサイトメトリーによって CD16、NKG2A/D、TRAIL、NKP46/NKP30、Ki67、CD38/HLA-DR などの特定のマーカーの発現を評価することによって研究されます。 ＮＫ細胞機能は、適切な刺激を用いて一晩ＰＢＭＣをインキュベーションして、ＩＦＮ－ｇ／ＴＮＦ－α産生およびＣＤ１０７脱顆粒を試験することによって研究される。
   • 制御性T細胞（Treg）の分析：CD3、CD4、CD25、FoxP3、およびCD45RAで共染色されたPBMC全体で、頻度、表現型、および機能が研究されます。
   • IL15、IL6、CXCL9、CXCL10、IFN-g、IL28 などのサイトカイン、ケモカイン、ISG の血清濃度は、Luminex 技術によって患者の血清で分析されます。
2. DAA 療法に反応しないベースライン予測因子の同定 抗ウイルス免疫反応が、プロテアーゼ阻害剤を含むまたは含まない治療法に反応しない場合の影響の解明