Dient het microbioom van de menselijke darm als een nieuw gepersonaliseerd therapeutisch doelwit voor coronaire atherosclerose?

Invoering:

Het menselijke gastro-intestinale systeem is bevolkt met een verscheidenheid aan symbiotische micro-organismen, namelijk microbiota. Het totale gewicht is ongeveer 2 kilogram en bevat biljoenen micro-organismen. Het microbioom is de totale genetische (metagenomische) gegevens van de microbiota. In de afgelopen jaren heeft de ontwikkeling van efficiënte methoden voor genoomsequencing en bio-informatica snelle en nauwkeurige kwantificering en kwalificatie van het microbioom mogelijk gemaakt, waardoor microbioomanalyse de leidende methode van microbiota-onderzoek is geworden.

Coronaire hartziekte (CAD) was wereldwijd verantwoordelijk voor meer dan 8 miljoen sterfgevallen per jaar. Met name het acuut coronair syndroom (ACS) blijft een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit en is jaarlijks verantwoordelijk voor meer dan 1 miljoen ziekenhuisopnames in de Verenigde Staten. Het pathofysiologische kenmerk van ACS is coronaire trombose veroorzaakt door atherosclerotische plaquebeschadiging, waarbij twee soorten verwondingen worden beschreven. De eerste is plaqueruptuur, wat nog steeds de meest voorkomende oorzaak is van coronaire atherotrombose, en de tweede is oppervlakkige plaque-erosie, die steeds vaker wordt herkend. In tegenstelling tot plaqueruptuur hebben laesies die worden veroorzaakt door erosie geen dunne vezelige kapjes, overvloedige ontstekingscellen of een grote lipidenkern, maar zijn ze eerder rijk aan extracellulaire matrix, zoals proteoglycanen en glycosaminoglycanen.

Beeldvormingsonderzoeken zoals coronaire computertomografische angiografie (CCTA) en diagnostische coronaire katheterisaties met of zonder optische coherentietomografie (OCT) worden in toenemende mate gebruikt in de klinische praktijk om het mechanisme te karakteriseren dat verantwoordelijk is voor onstabiele/kwetsbare atherosclerotische plaque.

De menselijke darmmicrobiota interageert uitgebreid met de gastheer door middel van metabole uitwisseling en co-metabolisme van substraten; daardoor bijdragen aan een verscheidenheid aan metabolische en immunologische mechanismen in het menselijk lichaam. CAD is een belangrijk interessegebied in microbiota-onderzoek en er zijn verschillende bevindingen die de darmmicrobiota verbinden met CAD-pathofysiologie. Ten eerste werd de microbiota geassocieerd met het metabool syndroom, namelijk obesitas en insulineresistentie. Er wordt verondersteld dat de darmmicrobiota de vetzuren met een korte keten kan verhogen, wat uiteindelijk de eetlust verhoogt en zo obesitas veroorzaakt. Een andere hypothese is dat endotoxinen in de darmflora zich in de bloedbaan kunnen verplaatsen, een ontstekingscascade kunnen veroorzaken die uiteindelijk atherosclerose kan bevorderen. Ten tweede kan de microbiota ook een rol spelen bij de ontwikkeling van atherosclerose. Bij patiënten met symptomatische atherosclerose is er een uniek microbioompatroon dat pro-inflammatoire eigenschappen kan hebben. Onlangs werd een uniek microbieel patroon gevonden bij patiënten met een hoog cardiovasculair risicoprofiel. Ten derde metaboliseert de darmmicrobiota fosfatidylcholine (lecitine) uit de voeding om de metaboliet trimethylamine-N-oxide (TMAO) te produceren, wat geassocieerd is met een verhoogd risico op cardiovasculaire gebeurtenissen.

De tot nu toe gepubliceerde gegevens hebben uitsluitend betrekking op de interactie tussen het menselijke darmmicrobioom en cardiovasculaire risicofactoren. Voor zover de onderzoeker weet en begrijpt, ontbreekt de microbioomanalyse van patiënten met een vastgestelde diagnose van CAD (inclusief ACS).

Doelstellingen:

Het doel van de huidige studie is om de darmmicrobiota van patiënten met symptomatische CAD te onderzoeken, zowel in stabiele als tijdens acute fasen. De onderzoekers veronderstellen dat de studiedeelnemers een unieke microbioomsignatuur zouden presenteren die een nieuw inzicht zou kunnen geven in de pathofysiologie van atherosclerotische CAD, terwijl het mogelijke therapeutische implicaties zou bieden.

Na het vaststellen van de unieke microbioomsignatuur in een groot cohort van CAD-patiënten, zouden de onderzoekers het correleren met TMAO-niveaus om zijn rol in de pathofysiologie van CAD verder te onderzoeken. In de laatste fase zouden de onderzoekers manieren proberen te vinden om gepersonaliseerde behandelingsopties aan te passen om de "pro-atherosclerotische" darmmicrobiota te veranderen. Door gegevens uit de huidige studie te gebruiken met de vorige 1000 patiëntencohort van de onderzoekers met bekend microbioom en voedingsprofiel, zou het in staat zijn om te zoeken naar een specifiek doelwit voor voedingsinterventie, zoals probiotica. Vervolgens zouden de onderzoekers de patiënten monitoren door het microbioom te sequencen na de voedingsinterventie.

methoden:

Studie ontwerp en werving. Deelnemers aan de studie zijn patiënten van 30-80 jaar die aankomen in het Rabin Medical Center met vermoedelijke CAD en in staat om geïnformeerde toestemming te geven. Deelnemers zullen medische, leefstijl- en voedingsvragenlijsten invullen. Tijdens de ziekenhuisopname zullen bloeddruk- en hartslagmetingen worden uitgevoerd, evenals bloedonderzoeken en fecale monsters en / of rectale uitstrijkjes. Om verdenking op atherosclerotische ziekte te evalueren en/of te behandelen, zullen deelnemers een CT-scan en/of hartkatheterisatie ondergaan in overeenstemming met de zorgstandaard en op basis van de beslissing van de behandelend cardioloog. Diagnostiek en behandelingsopties zijn alleen gebaseerd op de medische toestand van de deelnemers en ongeacht het bovengenoemde onderzoeksprotocol.

De controlegroep zal worden geselecteerd om een ​​qua leeftijd, geslacht en cardiovasculaire risicofactoren gematchte groep zonder huidig ​​CAD te vertegenwoordigen. Verdere uitsluitingscriteria in de controlegroep zijn antibioticagebruik in de volgende 3 maanden, inflammatoire darmziekte of andere significante chronische ziekte die de microbiota kan beïnvloeden (zoals kanker, auto-immuunziekte en chronische immunosuppressieve behandeling). De controlegroep zal cardiale CT of coronaire angiografie ondergaan op basis van klinische verdenking om CAD uit te sluiten en ongeacht het studieprotocol.

Bloedstalen. 10 ml veneus bloed zal worden verzameld in ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en gel met stollingsactivator bevattende buisjes van de ingeschreven patiënten bij alle studiedeelnemers. De concentraties van serumcreatinine, troponine, creatinefosfokinase (CPK), hemoglobine, triglyceriden (TG), totaal cholesterol (TC), lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL), lipoproteïnen met lage dichtheid (LDL), glucose, c-reactief proteïne ( CRP), b-type natriuretisch peptide (BNP) en hemoglobine A1c (HbA1C) zullen worden gemeten door een automatische biochemische analysator.

Bovendien zullen de niveaus van TMAO worden gemeten uit bloedplasma met behulp van Ultra-High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometric - Multiple Reaction Monitoring (UHPLC-MS/MRM) zoals eerder beschreven.

Voedingsprofilering. Alle deelnemers zullen hun gewoonten van voedselconsumptie rapporteren door de Food Frequency Questionnaire (FFQ) in te vullen.

Cardiale CT-analyse. Geselecteerde deelnemers ondergaan CT-angiografie voor de evaluatie en kwantificering van CAD met behulp van een 256-slice-systeem (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Gegevens worden verkregen met een collimatie van 96 x 0,625 mm en een portaalrotatietijd van 330 ms. Intraveneuze injectie van 60 tot 90 ml niet-ionisch contrastmiddel met een stroomsnelheid van 5 ml/s wordt gevolgd door een bolus met zoutoplossing van 30 ml (3 ml/s). Acquisitie wordt uitgevoerd tijdens het inhouden van de inspiratoire adem, terwijl het elektrocardiogram gelijktijdig wordt opgenomen om, afhankelijk van de hartslag, retrospectieve of prospectieve poorting van de gegevens mogelijk te maken. Alle afbeeldingen worden gereconstrueerd met een plakdikte van 0,67 mm en een plakverhoging van 0,34 mm. De volledige dataset wordt verzonden naar een speciaal CT-werkstation met een 3-dimensionale reconstructietool die speciaal is ontworpen voor coronaire angiografie (Philips Intellispace Portal, versie 7.0) om multiplanaire reformaties en kwantitatieve plaque-analyse mogelijk te maken. Een onafhankelijke lezer beoordeelt alle onderzoeken. Elk bloedvat met significante stenose zal worden geanalyseerd in gebogen multiplanaire geherformatteerde beelden in lange-as- en dwarsdoorsnede-aanzichten. Diameters op de plaats van maximale stenose en bij proximale en distale referenties zullen worden gemeten. De mate van stenose wordt berekend als de verhouding van het verschil tussen de diameter bij maximale stenose en het gemiddelde van de diameters bij de proximale en distale referenties gedeeld door het gemiddelde van de diameters bij proximale en distale referenties en uitgedrukt als percentage. De remodelleringsindex wordt berekend als het buitenste vaatoppervlak op de plaats van maximale stenose gedeeld door het gemiddelde van de buitenste vaatoppervlakken bij proximale en distale referenties. Positieve verbouwing wordt gedefinieerd als een verbouwingsindex ≥ 1,05. Plaquevolume wordt automatisch berekend als het volume van alle voxels die zijn gesegmenteerd tussen de luminale en buitenste bloedvatgrenzen op gekromde multiplanaire geherformatteerde beelden. Proximale en distale referenties zullen worden gebruikt als de proximale en distale uiteinden van de plaques. De onderzoekers rapporteren het totale volume van de plaque en de volumes van de subtypes van de plaque: verkalkte, niet-verkalkte en gemengde plaques.

Hartkatheterisatie en percutane coronaire interventie (PCI). Patiënten worden opgenomen in het katheterisatielaboratorium op basis van hun klinische presentatie, rekening houdend met de huidige ESC/AHA klinische richtlijnen. De hartkatheterisatieprocedure zal worden uitgevoerd met behulp van standaard percutane technieken via de radiale of femorale arterie. Coronaire laesies worden door de operator geëvalueerd in termen van stenose door visuele schatting of andere objectieve metingen, zoals kwantitatieve coronaire analyse (QCA). Coronaire interventie, inclusief ballonangioplastiek en stentimplantatie, zal worden uitgevoerd indien nodig en in overeenstemming met de ernst van coronaire stenose, d.w.z. (stenose met een diameter van ≥70%). Aanvullende beeldvorming van de kransslagader (OCT of intravasculaire echografie) wordt uitgevoerd naar goeddunken van de operator en ongeacht het onderzoeksprotocol. Alle patiënten zullen tijdens de procedure worden behandeld met antistolling (meestal ongefractioneerde heparine) met zorgvuldige controle van de geactiveerde stollingstijd tussen 250-300 seconden. Na de angioplastiekprocedure zullen alle patiënten gedurende 6-12 maanden worden behandeld met een dubbele anti-bloedplaatjestherapie die aspirine en P2Y12-remmer (clopidogrel, prasugrel of ticagrelor, volgens de klinische indicatie) combineert, tenzij er een contra-indicatie is, zoals behandeling met orale antistollingsmiddelen.

Genomische DNA-extractie en filtering. Genomisch DNA uit ontlastingsmonsters zal worden gezuiverd met behulp van PowerMag Soil DNA-isolatiekit (MoBio), geoptimaliseerd voor het Tecan geautomatiseerde platform. Voor shotgun-sequencing wordt 100 ng gezuiverd DNA geschoren met een Covaris E220X sonicator.

Microbioom analyse. Microbioommonsters zullen worden verwerkt door een geautomatiseerde robotpijplijn in 96-wells-formaat. Elke verzamelde steekproefgroep wordt robotisch verwerkt voor zowel 16S- als metagenomische sequencing.

Op het microbioom gebaseerde functies genereren. De onderzoekers zullen een computationele pijplijn gebruiken en verder uitbreiden die is ontwikkeld voor het genereren van een rijke reeks functies uit een metagenomische steekproef. Deze functies zullen de basis vormen voor modellen die op microbioom gebaseerde handtekeningen identificeren.

Bacteriële en virale abundanties - Het in kaart brengen van het metagenoommonster naar een referentiebacteriële genoomdatabase, en vervolgens het aantal aflezingen tellen voor elke bacterie, resulterend in een vector van relatieve bacterie-abundanties voor elk monster.

Bacteriële diversiteit - Met behulp van de hierboven afgeleide relatieve bacterie-abundanties, zullen de onderzoekers verschillende metingen van de diversiteit van bacteriën en virussen in een metagenoommonster berekenen (bijv. Shannon-entropie van de relatieve abundantievector, aantal bacteriën boven een minimaal niveau van abundantie), zoals monsterdiversiteit bleek geassocieerd te zijn met bepaalde fysiologische aspecten van de gastheer, zoals algehele adipositas en insulineresistentie.

Bacteriële groeisnelheid - Voor elk metagenoommonster zullen de onderzoekers een vector berekenen die overeenkomt met de groeisnelheid van elke bacterie in het monster, met behulp van een nieuwe methode die onlangs voor dit doel is ontwikkeld. Kort gezegd, door het patroon van sequencing leesdekking (diepte) over de lengte van verschillende bacteriële genomen te onderzoeken, ontdekten de onderzoekers dat veel bacteriën een prototypisch dekkingspatroon vertonen, bestaande uit een enkele trog en een enkele piek. Met name valt de locatie van de piek samen met de bekende replicatieoorsprong van de bacterie, wat suggereert dat de toegevoegde leesdekking nabij de piek nieuw gerepliceerd DNA vertegenwoordigt. Voor een bepaalde bacterie varieert de verhouding tussen de piek- en daldekking sterk tussen monsters van verschillende microbiomen van de menselijke darm, waarbij hoge verhoudingen vergelijkbaar zijn met die verkregen tijdens de exponentiële groeifase van bacteriën die in cultuur worden gekweekt, en lage verhoudingen die vergelijkbaar zijn met groei in stationaire fase.

Genabundanties - De onderzoekers zullen de relatieve abundanties van genen in metagenoommonsters berekenen door een vergelijkbare benadering toe te passen als hierboven voor het afleiden van relatieve abundanties van bacteriën. Daartoe zullen de onderzoekers, in plaats van de uitlezingen in kaart te brengen in de referentiedatabase van het bacteriële genoom, ze in kaart brengen in een referentiedatabase van bacteriële genen die onlangs is uitgebreid en die gezamenlijk meer dan 3 miljoen verschillende bacteriële genen bevat. De afgeleide genabundantievectoren zijn complementair aan de bacterieabundantievectoren, met als voordeel dat ze in kaart worden gebracht op genen waarvan het inbedding van het bacteriële genoom onbekend is, waardoor meer metagenoomsequencing-uitlezingen in kaart kunnen worden gebracht, en met het nadeel dat een veel grotere kenmerkvector wordt geproduceerd.

Biologische pathway-abundanties - Als een andere reeks kenmerken die informatie verschaffen op het functionele niveau van de microbiota, zullen de onderzoekers de KEGG-database van biologische pathways51 en de bovenstaande vector van gen-abundantie van elk monster gebruiken om een ​​abundantiescore voor elke biologische pathway te berekenen. Het belangrijkste voordeel van deze reeks kenmerken is dat de associaties directe hypothesen opleveren met betrekking tot de onderliggende mechanismen waardoor de microbiota mogelijk betrokken is bij het gecorreleerde fenotype.

Monster opslag. De monsters, het resterende DNA en de ingevroren serums worden opgeslagen in vriezers van -80C. Onverwerkte ontlastingsmonsters (zo worden bijvoorbeeld niet alle jaarlijks verzamelde monsters in eerste instantie verwerkt) worden ook opgeslagen in vriezers van -80°C.

Statistische analyse. Klinische gegevens zoals vitale functies, cardiovasculaire risicofactoren (leeftijd, geslacht, lipidenprofiel, glycemische index, rookstatus, eerdere CAD), chronische comorbiditeiten, regelmatig drugsgebruik, beeldvormingsresultaten op cardiale CT en/of hartkatheterisatie evenals niveaus van cardiale enzymen zullen worden verzameld in het Rabin Medical Center. Op het Weizmann Institute of Science, op de afdeling computerwetenschap van het Segal Lab, zullen de onderzoekers de gegevens analyseren. Voor elke parameter zullen associatieanalyses worden uitgevoerd om alle microbioomparameters te identificeren die geassocieerd zijn met deze klinische parameters.

Na analyse van de kenmerken van het microbioom bij die patiënten, waar bekende probiotische en/of voedingsinterventies tot de gewenste verandering kunnen leiden, zullen de onderzoekers ingrijpen en vervolgens het microbioom monitoren na de interventie.