Czy ludzki mikrobiom jelitowy służy jako nowy spersonalizowany cel terapeutyczny dla miażdżycy tętnic wieńcowych?

Wstęp:

Ludzki układ pokarmowy jest zaludniony różnymi mikroorganizmami symbiotycznymi, a mianowicie mikrobiomem. Jego całkowita waga wynosi około 2 kilogramów i zawiera biliony mikroorganizmów. Mikrobiom to całkowite dane genetyczne (metagenomiczne) mikrobiomu. W ostatnich latach rozwój wydajnych metod sekwencjonowania genomu oraz bioinformatyki umożliwił szybkie i dokładne kwantyfikowanie i kwalifikację mikrobiomu, czyniąc analizę mikrobiomu wiodącą metodą badań mikrobiomu.

Choroba wieńcowa (CAD) jest przyczyną ponad 8 milionów zgonów rocznie na całym świecie. W szczególności ostry zespół wieńcowy (ACS) pozostaje główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności i odpowiada za ponad 1 milion przyjęć do szpitali w Stanach Zjednoczonych rocznie. Patofizjologiczną cechą charakterystyczną OZW jest zakrzepica wieńcowa spowodowana uszkodzeniem blaszki miażdżycowej, przy czym opisano dwa rodzaje urazów. Pierwszym z nich jest pęknięcie blaszki miażdżycowej, które pozostaje najczęstszą przyczyną zakrzepicy w tętnicach wieńcowych, a drugim coraz częściej rozpoznawana powierzchowna erozja blaszki miażdżycowej. W przeciwieństwie do pęknięcia płytki, zmiany spowodowane erozją nie mają cienkich włóknistych czapeczek, obfitych komórek zapalnych ani dużego rdzenia lipidowego, ale są raczej bogate w macierz zewnątrzkomórkową, taką jak proteoglikany i glikozaminoglikany.

Badania obrazowe, takie jak koronarograficzna tomografia komputerowa (CCTA) i diagnostyczne cewnikowanie wieńcowe z optyczną koherentną tomografią (OCT) lub bez niej, są coraz częściej stosowane w praktyce klinicznej w celu scharakteryzowania mechanizmu odpowiedzialnego za niestabilną/wrażliwą blaszkę miażdżycową.

Ludzka mikroflora jelitowa intensywnie oddziałuje z gospodarzem poprzez wymianę metaboliczną i współmetabolizm substratów; w ten sposób przyczyniają się do różnych mechanizmów metabolicznych i immunologicznych w organizmie człowieka. CAD jest głównym obszarem zainteresowania badań mikroflory i istnieje kilka odkryć, które łączą mikroflorę jelitową z patofizjologią CAD. Po pierwsze, mikrobiota była związana z zespołem metabolicznym, czyli otyłością i insulinoopornością. Przypuszcza się, że mikroflora jelitowa może zwiększać krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, które ostatecznie zwiększają apetyt, powodując w ten sposób otyłość. Inna hipoteza głosi, że endotoksyny mikroflory jelitowej mogą przemieszczać się do krwioobiegu, wywołując kaskadę zapalną, która ostatecznie sprzyja miażdżycy. Po drugie, mikroflora może również odgrywać rolę w rozwoju miażdżycy. U pacjentów z objawową miażdżycą występuje unikalny wzór mikrobiomu, który może mieć właściwości prozapalne. Niedawno odkryto unikalny wzór drobnoustrojów wśród pacjentów z wysokim profilem ryzyka sercowo-naczyniowego. Po trzecie, mikroflora jelitowa metabolizuje dietetyczną fosfatydylocholinę (lecytynę) w celu wytworzenia metabolitu N-tlenku trimetyloaminy (TMAO), który wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zdarzeń sercowo-naczyniowych.

Opublikowane dotychczas dane dotyczą wyłącznie interakcji między ludzkim mikrobiomem jelitowym a czynnikami ryzyka sercowo-naczyniowego. Zgodnie z najlepszą wiedzą i zrozumieniem badacza brakuje analizy mikrobiomu pacjentów z rozpoznaną chorobą wieńcową (w tym OZW).

Cele:

Celem obecnego badania jest zbadanie mikroflory jelitowej pacjentów z objawową CAD, zarówno w fazie stabilnej, jak iw fazie ostrej. Badacze stawiają hipotezę, że uczestnicy badania przedstawią unikalną sygnaturę mikrobiomu, która może zapewnić nowy wgląd w patofizjologię miażdżycowej choroby wieńcowej, jednocześnie dostarczając domniemanych implikacji terapeutycznych.

Po ustaleniu unikalnej sygnatury mikrobiomu w dużej kohorcie pacjentów z CAD, badacze skorelowali ją z poziomami TMAO w celu dalszego zbadania jej roli w patofizjologii CAD. Na ostatnim etapie badacze próbowaliby znaleźć sposoby dostosowania spersonalizowanych opcji leczenia, aby zmienić „promiażdżycową” mikroflorę jelitową. Wykorzystując dane z obecnego badania z kohortą poprzednich 1000 pacjentów badaczy o znanym mikrobiomie i profilu żywieniowym, byłoby w stanie wyszukać konkretny cel interwencji żywieniowej, taki jak probiotyki. Następnie badacze monitorowaliby pacjentów z sekwencjonowaniem mikrobiomu po interwencji żywieniowej.

Metody:

Projektowanie studiów i rekrutacja. Uczestnikami badania będą pacjenci w wieku 30-80 lat zgłaszający się do Centrum Medycznego Rabin z podejrzeniem CAD i zdolni do wyrażenia świadomej zgody. Uczestnicy będą dostarczać kwestionariusze medyczne, dotyczące stylu życia i żywienia. Podczas hospitalizacji będą wykonywane pomiary ciśnienia krwi i tętna, a także badania krwi i próbki kału i/lub wymazy z odbytu. W celu oceny i/lub leczenia podejrzenia choroby miażdżycowej uczestnicy zostaną poddani tomografii komputerowej serca i/lub cewnikowaniu serca zgodnie ze standardami opieki i na podstawie decyzji kardiologa prowadzącego. Diagnostyka i opcje leczenia będą oparte wyłącznie na stanie zdrowia uczestników i niezależnie od powyższego protokołu badania.

Grupa kontrolna zostanie wybrana tak, aby reprezentować grupę dopasowaną pod względem wieku, płci i czynników ryzyka sercowo-naczyniowego bez aktualnej CAD. Kolejnymi kryteriami wykluczającymi w grupie kontrolnej będzie przyjmowanie antybiotyków w ciągu następnych 3 miesięcy, nieswoiste zapalenie jelit lub inna istotna choroba przewlekła, która może wpływać na mikroflorę bakteryjną (taka jak rak, choroba autoimmunologiczna i przewlekłe leczenie immunosupresyjne). Grupa kontrolna zostanie poddana tomografii komputerowej serca lub koronarografii zgodnie z klinicznym podejrzeniem w celu wykluczenia choroby wieńcowej i niezależnie od protokołu badania.

Próbki krwi. 10 ml krwi żylnej zostanie pobrane do kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i żelu z probówkami zawierającymi aktywator krzepnięcia od włączonych pacjentów u wszystkich uczestników badania. Stężenia kreatyniny, troponiny, fosfokinazy kreatynowej (CPK), hemoglobiny, triglicerydów (TG), cholesterolu całkowitego (TC), lipoprotein o dużej gęstości (HDL), lipoprotein o małej gęstości (LDL), glukozy, białka c-reaktywnego ( CRP), peptyd natriuretyczny typu b (BNP) oraz hemoglobina A1c (HbA1C) zostaną zmierzone za pomocą automatycznego analizatora biochemicznego.

Ponadto poziomy TMAO będą mierzone w osoczu krwi przy użyciu ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej - spektrometrii mas - monitorowania wielu reakcji (UHPLC-MS/MRM), jak opisano wcześniej.

Profilowanie żywieniowe. Wszyscy uczestnicy zgłoszą swoje nawyki związane z konsumpcją żywności, wypełniając Kwestionariusz Częstotliwości Żywności (FFQ).

Analiza TK serca. Wybrani uczestnicy zostaną poddani angiografii CT w celu oceny i oceny ilościowej CAD przy użyciu systemu składającego się z 256 warstw (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Dane będą zbierane przy kolimacji 96 X 0,625 mm i czasie obrotu gantry 330 ms. Po dożylnym wstrzyknięciu 60 do 90 ml niejonowego środka kontrastowego z szybkością przepływu 5 ml/s nastąpi bolus 30 ml roztworu soli fizjologicznej (3 ml/s). Akwizycja zostanie przeprowadzona podczas wstrzymania oddechu podczas wdechu, podczas gdy elektrokardiogram będzie rejestrowany jednocześnie, aby umożliwić, w zależności od częstości akcji serca, retrospektywne lub prospektywne bramkowanie danych. Wszystkie obrazy zostaną zrekonstruowane z grubością warstwy 0,67 mm i przyrostem warstwy 0,34 mm. Kompletny zestaw danych zostanie przesłany do dedykowanej stacji roboczej CT z trójwymiarowym narzędziem do rekonstrukcji zaprojektowanym specjalnie do koronarografii (Philips Intellispace Portal, wersja 7.0), aby umożliwić wielopłaszczyznowe reformy i ilościową analizę blaszki miażdżycowej. Niezależny czytelnik przejrzy wszystkie badania. Każde naczynie zawierające znaczące zwężenie zostanie przeanalizowane na zakrzywionych, wielopłaszczyznowych, ponownie sformatowanych obrazach w osi długiej iw przekroju poprzecznym. Zostaną zmierzone średnice w miejscu maksymalnego zwężenia oraz w proksymalnych i dystalnych punktach odniesienia. Stopień zwężenia zostanie obliczony jako stosunek różnicy między średnicą przy maksymalnym zwężeniu a średnią średnicą w proksymalnym i dystalnym punkcie odniesienia, podzielony przez średnią średnic w proksymalnym i dalszym punkcie odniesienia i wyrażony w procentach. Wskaźnik remodelingu zostanie obliczony jako zewnętrzna powierzchnia naczynia w miejscu największego zwężenia podzielona przez średnią zewnętrzną powierzchnię naczynia w proksymalnych i dystalnych punktach odniesienia. Pozytywna przebudowa będzie zdefiniowana jako wskaźnik przebudowy ≥ 1,05. Objętość blaszki zostanie automatycznie obliczona jako objętość wszystkich wokseli podzielonych między światłami a zewnętrznymi granicami naczynia na zakrzywionych wielopłaszczyznowych przeformatowanych obrazach. Proksymalne i dystalne punkty odniesienia zostaną użyte jako proksymalne i dystalne końce blaszek. Badacze podają całkowitą objętość blaszki miażdżycowej i objętości podtypów blaszki miażdżycowej: blaszki zwapniałe, niezwapnione i mieszane.

Cewnikowanie serca i przezskórna interwencja wieńcowa (PCI). Pacjenci będą przyjmowani do pracowni cewnikowania zgodnie z ich obrazem klinicznym, z uwzględnieniem aktualnych wytycznych klinicznych ESC/AHA. Procedura cewnikowania serca zostanie przeprowadzona przy użyciu standardowych technik przezskórnych przez tętnicę promieniową lub udową. Zmiany w naczyniach wieńcowych zostaną ocenione przez operatora pod kątem zwężenia za pomocą oceny wizualnej lub innych obiektywnych pomiarów, takich jak ilościowa analiza wieńcowa (QCA). Interwencja wieńcowa, w tym angioplastyka balonowa i implantacja stentu, zostanie wdrożona w razie potrzeby i w zależności od ciężkości zwężenia tętnicy wieńcowej, tj. (zwężenie średnicy ≥70%). Dodatkowa koronarografia (OCT lub ultrasonografia wewnątrznaczyniowa) zostanie przeprowadzona według uznania operatora i niezależnie od protokołu badania. Wszyscy pacjenci będą podczas zabiegu leczeni antykoagulacją (głównie heparyną niefrakcjonowaną) z uważnym monitorowaniem czasu krzepnięcia po aktywacji w zakresie 250-300 sekund. Po zabiegu angioplastyki wszyscy pacjenci będą leczeni podwójną terapią przeciwpłytkową łączącą aspirynę i inhibitor P2Y12 (klopidogrel, prasugrel lub tikagrelor w zależności od wskazania klinicznego) przez 6-12 miesięcy, o ile nie wystąpią przeciwwskazania, np. leczenie doustnymi lekami przeciwzakrzepowymi.

Ekstrakcja i filtrowanie genomowego DNA. Genomowe DNA z próbek kału zostanie oczyszczone przy użyciu zestawu do izolacji DNA PowerMag Soil (MoBio) zoptymalizowanego pod kątem zautomatyzowanej platformy Tecan. Do sekwencjonowania shotgun, 100 ng oczyszczonego DNA zostanie pocięte za pomocą sonikatora Covaris E220X.

Analiza mikrobiomu. Próbki mikrobiomu będą przetwarzane przez zautomatyzowany automatyczny rurociąg w formacie 96-dołkowym. Każda zebrana grupa próbek zostanie przetworzona zautomatyzowana zarówno pod kątem sekwencjonowania 16S, jak i metagenomicznego.

Generowanie cech opartych na mikrobiomie. Badacze wykorzystają i dalej rozszerzą potok obliczeniowy, który został opracowany w celu generowania bogatego zestawu cech z próbki metagenomicznej. Te cechy będą podstawą modeli identyfikujących sygnatury oparte na mikrobiomie.

Liczebność bakterii i wirusów — mapowanie próbki metagenomu do referencyjnej bazy danych genomu bakteryjnego, a następnie zliczanie liczby odczytów mapowania dla każdej bakterii, co daje wektor względnej liczebności bakterii dla każdej próbki.

Różnorodność bakterii - korzystając z względnych liczebności bakterii uzyskanych powyżej, badacze obliczą kilka miar różnorodności bakterii i wirusów w próbce metagenomu (np. Entropia Shannona wektora względnej liczebności, liczba bakterii powyżej pewnego minimalnego poziomu liczebności), jak wykazano, że różnorodność próbek jest związana z pewnymi aspektami fizjologicznymi gospodarza, takimi jak ogólna otyłość i insulinooporność.

Tempo wzrostu bakterii – dla każdej próbki metagenomu badacze obliczą wektor odpowiadający tempu wzrostu każdej bakterii w próbce, używając nowej metody, która została niedawno opracowana w tym celu. W skrócie, badając wzorzec pokrycia odczytu sekwencjonowania (głębokość) na całej długości różnych genomów bakteryjnych, badacze odkryli, że wiele bakterii wykazuje prototypowy wzór pokrycia, składający się z pojedynczego koryta i pojedynczego piku. Warto zauważyć, że położenie piku pokrywa się ze znanym początkiem replikacji bakterii, co sugeruje, że dodany zasięg odczytu w pobliżu piku reprezentuje nowo zreplikowane DNA. W przypadku dowolnej bakterii stosunek pokrycia szczytowego do minimalnego różni się znacznie w próbkach z różnych mikrobiomów ludzkich jelit, przy czym wysokie stosunki są podobne do uzyskiwanych podczas wykładniczej fazy wzrostu bakterii hodowanych w hodowli, a niskie stosunki są podobne do wzrostu w stacjonarnych faza.

Obfitość genów - Badacze obliczą względną liczebność genów w próbkach metagenomu, stosując podejście podobne do powyższego w celu uzyskania względnej obfitości bakterii. W tym celu, zamiast mapować odczyty do referencyjnej bazy danych genomu bakteryjnego, badacze zmapują je do referencyjnej bazy danych genów bakteryjnych, która została niedawno rozszerzona i która łącznie zawiera ponad 3 miliony różnych genów bakteryjnych. Pochodne wektory obfitości genów są komplementarne do wektorów obfitości bakterii, z zaletą polegającą na mapowaniu do genów, których osadzony genom bakteryjny jest nieznany, a tym samym umożliwia mapowanie większej liczby odczytów sekwencjonowania metagenomu, a wadą jest wytwarzanie znacznie większego wektora cech.

Liczebność szlaków biologicznych — jako kolejny zestaw cech, które dostarczają informacji na poziomie funkcjonalnym mikroflory, badacze wykorzystają bazę danych KEGG dotyczącą szlaków biologicznych51 i powyższy wektor obfitości genów każdej próbki, aby obliczyć wynik liczebności dla każdej ścieżki biologicznej. Kluczową zaletą tego zestawu cech jest to, że jego powiązania dostarczają bezpośrednich hipotez dotyczących podstawowych mechanizmów, poprzez które mikroflora może być zaangażowana w skorelowany fenotyp.

Przechowywanie próbek. Próbki oraz pozostałe DNA i zamrożone surowice będą przechowywane w zamrażarkach -80C. Nieprzetworzone próbki kału (np. nie wszystkie próbki pobierane co roku będą początkowo przetwarzane) będą również przechowywane w zamrażarkach o temperaturze -80°C.

Analiza statystyczna. Dane kliniczne, takie jak parametry życiowe, czynniki ryzyka sercowo-naczyniowego (wiek, płeć, profil lipidowy, indeks glikemiczny, palenie tytoniu, przebyta choroba wieńcowa), przewlekłe choroby współistniejące, regularne zażywanie narkotyków, wyniki badań obrazowych z tomografii komputerowej serca i/lub cewnikowania serca, jak również poziomy enzymów sercowych będą zbierane w Centrum Medycznym Rabin. W instytucie naukowym Weizmanna, na wydziale informatyki Segal Lab, śledczy przeanalizują dane. Dla każdego parametru zostaną przeprowadzone analizy asocjacyjne w celu zidentyfikowania wszystkich parametrów mikrobiomu, które są powiązane z tymi parametrami klinicznymi.

Po przeanalizowaniu sygnatur mikrobiomu u tych pacjentów, u których znane interwencje probiotyczne i/lub żywieniowe mogą doprowadzić do pożądanej zmiany, badacze interweniują, a następnie monitorują sekwencjonowanie mikrobiomu po interwencji.