Badanie korelacji między CIRBP dawcy a funkcją przeszczepionej nerki

Badanie miało charakter retrospektywnego, otwartego badania kohortowego, które obejmowało pacjentów zmarłych w okresie od stycznia 2016 r. do grudnia 2019 r. Postępowanie było zgodne z wytycznymi Krajowego programu dawstwa narządów od zmarłych w Chinach i obejmowało dawców nerek, którzy wybrali pomyślnie, z Trzeciego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Sun Yat-sena. Dawcy zostali wykluczeni, jeśli spełnili którykolwiek z poniższych warunków: a) nie posiadali próbki krwi; b) miał zanieczyszczone próbki krwi, które miały wpływ na poziomy CIRBP; (c) byli biorcami, którzy przeszli połączony przeszczep wielonarządowy; d) uczestniczyli w innych badaniach klinicznych; (e) miał w przeszłości przeszczepianie narządów; f) badacz uznał, że inne schorzenia nie kwalifikują się do włączenia do badania. Próbki krwi zostały pobrane od dawców przez organizacje zajmujące się pozyskiwaniem narządów (OPO) i wykorzystane do różnych badań za zgodą dawców. Wszyscy biorcy (207 biorców, 207 dawców) byli obserwowani długoterminowo po przeszczepieniu.

Śledczy postępowali zgodnie z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej (20) i Deklaracji Stambulskiej. Zgodę na to badanie uzyskano od Komisji ds. Przeszczepiania Narządów Ludzkich i Etyki Uniwersytetu Sun Yat-sena. Komisja ds. Etyki została utworzona zgodnie z Wytycznymi operacyjnymi Światowej Organizacji Zdrowia dotyczącymi przeglądu badań biomedycznych przez Komisję Etyki. Przydziału narządów przeprowadzono w sposób uczciwy i przejrzysty za pośrednictwem chińskiego systemu reagowania na przeszczepy narządów. Rodzaj dawstwa był dobrowolnie ustalany przez rodzinę dawcy, a po przeszczepieniu biorca był objęty kontrolą kontrolną. Zarówno rodzina dawcy, jak i biorca wyrazili zgodę na wykorzystanie próbek i danych klinicznych w badaniach.

Dane dawców uzyskano z chińskiego systemu reagowania na przeszczepy narządów, wypełnionego przez członków organizacji zajmujących się przeszczepami narządów. Dodatkowo część informacji o dawcach uzupełniono z elektronicznej dokumentacji medycznej. Dane biorcy uzyskano wyłącznie z klinicznych rejestrów elektronicznych. Badacze podzielili dawców i biorców na grupy z opóźnioną funkcją przeszczepu (DGF) i natychmiastową funkcją przeszczepu (IGF) w oparciu o wczesny stan czynności nerek biorcy. DGF zdefiniowano jako zmniejszenie dziennego stężenia kreatyniny w osoczu o mniej niż 10% w porównaniu z dniem poprzednim przez 3 kolejne dni w ciągu 1 tygodnia po operacji lub jeśli stężenie kreatyniny w surowicy (SCr) nie spadło do 400 μmol/l w ciągu 1 tygodnia po operacji. Biorców, u których nie rozwinął się DGF, sklasyfikowano jako IGF. U pacjentów wymagających ciągłej dializy po zabiegu chirurgicznym lub retransplantacji rozpoznawano pierwotną niewydolność nerek (PNF). Dodatkowo, jako dawców kryteriów rozszerzonych zdefiniowano osoby w wieku powyżej 60 lat lub w wieku od 50 do 59 lat spełniające co najmniej dwa z następujących kryteriów: końcowe stężenie kreatyniny w surowicy > 133 μmol/l, udar naczyniowo-mózgowy jako przyczyna zgonu oraz przebyta choroba nadciśnienie.

Pobieranie próbek Próbki krwi pełnej pobierano od dawcy na sali operacyjnej przed pobraniem narządów i transportowano do laboratorium na pokruszonym lodzie, przy średnim czasie transportu wynoszącym 2 godziny. Do przygotowania surowicy próbki krwi pełnej pozostawiono w temperaturze pokojowej na 2 godziny, a następnie odwirowano przy 1000 g przez 15 minut w temperaturze 2-8°C. Powstały supernatant zebrano i przechowywano w laboratorium w temperaturze -80°C. Przed badaniem próbki surowicy rozmrożono na pokruszonym lodzie i ponownie odwirowano przy 1000 g przez 15 minut w temperaturze 2-8°C.

Pomiar poziomu białka wiążącego RNA indukowalnego na zimno w surowicy CIRBP wykrywano przy użyciu zestawu ELISA (CSB-EL005440HU). Wzorzec białkowy rozcieńczono zgodnie z instrukcją i 100 µl standardu i próbek o różnych stężeniach (rozcieńczenie 1:10) dodano w dwóch powtórzeniach do 96-studzienkowej płytki. Płytkę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny w ciemności. Po inkubacji płyn ze dołków usunięto i do każdego dołka dodano 100 µl roztworu roboczego przeciwciała znakowanego biotyną. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, płytkę przemyto trzykrotnie roztworem płuczącym. Następnie do każdej studzienki dodano 100 µl roztworu powinowactwa znakowanego peroksydazą chrzanową. Po dodatkowej 1-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C płytkę przemyto pięć razy. Następnie do każdej studzienki dodano 90 µl roztworu substratu i po 15 minutach pojawienia się zabarwienia w temperaturze 37°C, w celu zatrzymania reakcji zastosowano 50 µl roztworu kończącego. Absorbancję mierzono przy 450 nm w ciągu 5 minut przy użyciu czytnika mikropłytek, a stężenia obliczano w oparciu o krzywą standardową.