Tutkimus korrelaatiosta luovuttajan CIRBP:n ja siirretyn munuaisen toiminnan välillä

Tutkimus oli retrospektiivinen avoin kohorttitutkimus, joka sisälsi kuolleita potilaita tammikuusta 2016 joulukuuhun 2019. Se noudatti Kiinan kuolleiden elinten luovutuksen kansallisen ohjelman ohjeita ja osallistui menestyneisiin munuaisten luovuttajiin Sun Yat-senin yliopiston kolmannesta sidossairaalasta. Luovuttajat suljettiin pois, jos he täyttivät jonkin seuraavista ehdoista: (a) heiltä puuttui verinäyte; (b) oli kontaminoituneita verinäytteitä, jotka vaikuttivat CIRBP-tasoihin; (c) olivat vastaanottajia, joille tehtiin yhdistetyt usean elimen siirrot; d) osallistuivat muihin kliinisiin tutkimuksiin; e) hänellä on ollut elinsiirto; (f) hänellä oli muita olosuhteita, jotka tutkija ei katsonut soveltumattomiksi rekisteröitäväksi. Elinhankintaorganisaatiot (OPO) keräsivät luovuttajilta verinäytteet, joita käytettiin erilaisiin tutkimuksiin luovuttajien suostumuksella. Kaikkia vastaanottajia (207 vastaanottajaa, 207 luovuttajaa) seurattiin pitkällä aikavälillä elinsiirron jälkeen.

Tutkijat noudattivat Helsingin julistuksessa (20) ja Istanbulin julistuksessa esitettyjä periaatteita. Hyväksyntä tälle tutkimukselle saatiin Sun Yat-senin yliopiston ihmiselinten transplantaatio- ja etiikkakomitealta. Eettinen toimikunta on muodostettu Maailman terveysjärjestön (WHO) Biolääketieteen tutkimuksen eettisen komitean toimintaohjeiden mukaisesti. Elinten jakaminen suoritettiin reilulla ja läpinäkyvällä tavalla Kiinan elinsiirtojen vastausjärjestelmän kautta. Luovuttajan perhe päätti vapaaehtoisesti luovutuksen tyypin, ja vastaanottajalle tehtiin seurantaa elinsiirron jälkeen. Sekä luovuttajan perhe että vastaanottaja antoivat suostumuksen näytteiden ja kliinisen tiedon käyttämiseen tutkimuksessa.

Luovuttajatiedot saatiin China Organ Transplant Response System -järjestelmästä, jonka täyttivät elinsiirtojärjestöjen jäsenet. Lisäksi joitain luovuttajatietoja täydennettiin kliinisistä sähköisistä potilaskertomuksista. Vastaanottajatiedot saatiin pelkästään kliinisistä sähköisistä tietueista. Tutkijat luokittelivat luovuttajat ja vastaanottajat viivästyneen siirteen toiminnan (DGF) ja välittömän siirteen toiminnan (IGF) ryhmiin vastaanottajan varhaisen munuaistoiminnan tilan perusteella. DGF määritettiin päivittäisen plasman kreatiniinin laskuksi alle 10 % edellisestä päivästä kolmena peräkkäisenä päivänä viikon sisällä leikkauksen jälkeen, tai jos seerumin kreatiniini (SCr) ei laskenut arvoon 400 μmol/L viikon sisällä leikkauksesta. Vastaanottajat, joille ei kehittynyt DGF:ää, luokiteltiin IGF:ksi. Primaarinen toimintahäiriö (PNF) diagnosoitiin potilailla, jotka tarvitsivat jatkuvaa dialyysihoitoa leikkauksen tai uudelleensiirron jälkeen. Lisäksi kuluneiksi kriteereiksi luovuttajiksi määriteltiin yli 60-vuotiaat tai 50–59-vuotiaat, jotka täyttivät vähintään kaksi seuraavista kriteereistä: seerumin lopullinen kreatiniini > 133 μmol/L, aivoverenkiertohäiriö kuolinsyynä ja anamneesi verenpainetauti.

Näytteenotto Kokoverinäytteet otettiin luovuttajalta leikkaussalissa ennen elinten talteenottoa ja kuljetettiin jäämurskassa laboratorioon keskimääräisen kuljetuksen keston ollessa 2 tuntia. Seerumin valmistusta varten kokoverinäytteet jätettiin huoneenlämpötilaan 2 tunniksi, sitten sentrifugoitiin 1000 g:ssä 15 minuuttia 2-8 °C:n lämpötilassa. Saatu supernatantti kerättiin ja säilytettiin -80 °C:ssa laboratoriossa. Ennen testausta seeruminäytteet sulatettiin jäämurskassa ja sentrifugoitiin uudelleen 1000 g:llä 15 minuuttia 2-8 °C:ssa.

Kylmän indusoituvan RNA:ta sitovan proteiinin tason mittaaminen seerumissa CIRBP havaittiin käyttämällä ELISA-kittiä (CSB-EL005440HU). Proteiinistandardi laimennettiin ohjeiden mukaisesti ja 100 ui eri konsentraatioita standardia ja näytteitä (1:10 laimennus) lisättiin 96-kuoppaiselle levylle kahtena rinnakkaisena. Levyä inkuboitiin 37 °C:ssa 2 tuntia pimeässä. Inkuboinnin jälkeen kuopissa oleva neste heitettiin pois ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 ui biotiinileimattua vasta-aineen työliuosta. 37 °C:ssa 1 tunnin inkuboinnin jälkeen levy pestiin kolme kertaa pesuliuoksella. Sen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 ui piparjuuriperoksidaasilla leimattua affiniteettiliuosta. 1 tunnin lisäinkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa levy pestiin viisi kertaa. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 90 ui substraattiliuosta ja 15 minuutin värinkehityksen jälkeen 37 °C:ssa 50 ui lopetusliuosta käytettiin pysäyttämään reaktio. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 450 nm 5 minuutin sisällä käyttämällä mikrolevylukijaa, ja pitoisuudet laskettiin standardikäyrän perusteella.