Účinky jednoměsíční konzumace standardizovaného extraktu Aronia Melanocarpa na anémii u pacientů na hemodialýze

Vyhodnocení vzorků systémové redoxní plazmy bylo použito pro stanovení hladin následujících prooxidantů: superoxidový aniontový radikál (O2-), peroxid vodíku (H2O2), dusitany (NO2-) a index peroxidace lipidů měřený jako reaktivní kyselina thiobarbiturová látek (TBARS), zatímco ve vzorcích lyzátů erytrocytů byly stanoveny parametry antioxidačního obranného systému, jako jsou aktivity superoxiddismutázy (SOD) a katalázy (CAT) a hladina redukovaného glutathionu (GSH).

A) Stanovení indexu peroxidace lipidů (TBARS) Stupeň peroxidace lipidů ve vzorcích plazmy byl odhadnut měřením TBARS za použití 1% kyseliny thiobarbiturové v 0,05 NaOH, která byla inkubována se vzorkem při 100 °C po dobu 15 minut a měřena při 530 nm. TBA extrakt byl získán spojením 0,8 ml vzorku a 0,4 ml kyseliny trichloroctové (TCA); poté byly vzorky umístěny na led na 10 minut a centrifugovány po dobu 15 minut při 6000 ot./min. (1).

b) Stanovení dusitanů (NO2-)

Oxid dusnatý (NO) se rychle rozkládá za vzniku stabilních dusitanových/dusičnanových produktů. Hladina NO2- byla měřena a použita jako index produkce NO pomocí Griessova činidla. Pro stanovení NO2 v plazmě bylo 0,1 ml 3N PCA (perchloridová kyselina), 0,4 ml 20 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) a 0,2 ml plazmy umístěno na led po dobu 15 minut, poté centrifugováno po dobu 15 minut při 6000 ot./min. Po odlití supernatantu bylo přidáno 220 μl K2CO3. Dusitany byly měřeny při 550 nm. (2)

1. Stanovení superoxidového aniontového radikálu (O2-)

   Koncentrace superoxidových aniontových radikálů ve vzorcích plazmy byly měřeny pomocí činidla NTB (Nitro Blue Tetrazolium) v TRIS pufru (směs testu). Měření bylo provedeno při vlnové délce 530 nm. (3).

2. Stanovení peroxidu vodíku (H2O2)

   Měření H2O2 bylo založeno na oxidaci fenolové červeně H2O2 v reakci katalyzované křenovou peroxidázou. Dvě stě mikrolitrů perfuzátu nebo plazmy bylo vysráženo pomocí 800 ml čerstvě připraveného roztoku fenolové červeně; Následně bylo přidáno 10 μl (1:20) křenové peroxidázy (vyrobené bezprostředně před použitím). Hladina H2O2 byla měřena při 610 nm (4).

3. Stanovení redukovaného glutathionu (GSH)

   Hladina redukovaného glutathionu (GSH) byla stanovena na základě oxidace GSH prostřednictvím kyseliny 5,5-dithiobis-6,2-nitrobenzoové. Extrakt GSH byl získán kombinací 0,1 ml 0,1% EDTA, 400 μl hemolyzátu a 750 μl srážecího roztoku (obsahujícího 1,67 g kyseliny metafosforečné, 0,2 g EDTA, 30 g NaCl a naplněného destilovanou vodou do objemu 100 ml; roztok je stabilní po 3 týdny při +4C°). Hladina GSH byla měřena při 420 nm (5).

4. Stanovení antioxidačních enzymů (SOD, CAT)

Izolované erytrocyty byly třikrát promyty třemi objemy ledově studeného 0,9 mmol/l NaCl a pro stanovení aktivity CAT byly použity hemolyzáty obsahující asi 50 g Hb/l. Pro stanovení CAT byly použity CAT pufr, připravený vzorek hemolyzátu a 10 mM H2O2. Detekce byla provedena při 360 nm. Aktivita SOD byla stanovena epinefrinovou metodou. Hemolyzát byl smíchán s uhličitanovým pufrem a poté byl přidán epinefrin. Detekce byla provedena při 470 nm (6-10).

Hodnocení zánětlivého stavu Pro hodnocení zánětlivého stavu pacientů byly v obou sledovaných bodech (0 a 30. den) měřeny následující parametry: koncentrace C-reaktivního proteinu v séru - CRP a koncentrace tumor nekrotizujícího faktoru - TNF-α.

Koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) v séru byla stanovena turbidimetrickou metodou na Olympus AU680. Normální koncentrace CRP v séru je ≤ 5 mg/l. Mikrozánět je definován jako koncentrace CRP v séru 5 mg/l.

Plazmatické koncentrace TNF-a byly stanoveny enzymatickým imunoadsorbentním testem (ELISA) za použití komerčně dostupného vysoce citlivého nepřímého sendvičového enzymového imunosorbentního testu (Sigma Aldrich).

Hodnocení hematologických parametrů

V obou bodech zájmu byly u všech pacientů analyzovány hodnoty následujících hematologických parametrů:

Erytrocyty (Er), hemoglobin (Hb), hematokrit (Hct), erytrocytový index – střední korpuskulární objem (MCV), střední korpuskulární hemoglobin (MCH), střední korpuskulární koncentrace hemoglobinu (MCHC), sérová koncentrace laktátdehydrogenázy (LDH), sérový haptoglobin koncentrace a stav železa: koncentrace železa v séru, feritin; celková vazebná kapacita pro železo (TIBC), vazebná kapacita pro nenasycené železo (UIBC), saturace transferinu (TSAT), haptoglobin.