Wpływ miesięcznego spożycia standaryzowanego ekstraktu aronii melanocarpa na anemię u pacjentów poddawanych hemodializie

Ocena ogólnoustrojowego stanu redoks Próbki osocza wykorzystano do oznaczenia poziomu następujących proutleniaczy: anionorodnika ponadtlenkowego (O2-), nadtlenku wodoru (H2O2), azotynów (NO2-) oraz wskaźnika peroksydacji lipidów mierzonego jako reaktywny kwas tiobarbiturowy W próbkach lizatów erytrocytów oznaczono parametry systemu obrony antyoksydacyjnej, takie jak aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i katalazy (CAT) oraz poziom zredukowanego glutationu (GSH).

A) Oznaczanie wskaźnika peroksydacji lipidów (TBARS) Stopień peroksydacji lipidów w próbkach osocza oszacowano, mierząc TBARS, stosując 1% kwas tiobarbiturowy w 0,05 NaOH, który inkubowano z próbką w 100°C przez 15 min i mierzono w 530 nm. Ekstrakt TBA otrzymano przez połączenie 0,8 ml próbki i 0,4 ml kwasu trichlorooctowego (TCA); następnie próbki umieszczono na lodzie na 10 minut i wirowano przez 15 minut przy 6000 obr./min. (1).

b) Oznaczanie azotynów (NO2-)

Tlenek azotu (NO) rozkłada się szybko, tworząc stabilne produkty azotynowe/azotanowe. Zmierzono poziom NO2- i wykorzystano go jako wskaźnik wytwarzania NO, stosując odczynnik Griessa. W celu oznaczenia NO2 w osoczu 0,1 ml 3 N PCA (kwas nadchlorkowy), 0,4 ml 20 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,2 ml osocza umieszczono w lodzie na 15 min, następnie wirowano przez 15 min przy 6000 obr./min. Po odlaniu supernatantu dodano 220 μl K2CO3. Azotyny mierzono przy 550 nm. (2)

1. Oznaczanie anionorodników ponadtlenkowych (O2-)

   Stężenia anionorodników ponadtlenkowych w próbkach osocza mierzono przy użyciu odczynnika NTB (Nitro Blue Tetrazolium) w buforze TRIS (mieszanina testowa). Pomiar przeprowadzono przy długości fali 530 nm. (3).

2. Oznaczanie nadtlenku wodoru (H2O2)

   Pomiar H2O2 oparto na utlenieniu czerwieni fenolowej przez H2O2 w reakcji katalizowanej przez peroksydazę chrzanową. Dwieście mikrolitrów perfuzatu lub osocza wytrącono przy użyciu 800 ml świeżo przygotowanego roztworu czerwieni fenolowej; Następnie dodano 10 μl (1:20) peroksydazy chrzanowej (przygotowanej bezpośrednio przed użyciem). Poziom H2O2 mierzono przy 610 nm (4).

3. Oznaczanie zredukowanego glutationu (GSH)

   Poziom zredukowanego glutationu (GSH) określono na podstawie utleniania GSH kwasem 5,5-ditiobis-6,2-nitrobenzoesowym. Ekstrakt GSH otrzymano łącząc 0,1 ml 0,1% EDTA, 400 μl hemolizatu i 750 μl roztworu strącającego (zawierającego 1,67 g kwasu metafosforowego, 0,2 g EDTA, 30 g NaCl i dopełniono wodą destylowaną do 100 ml; roztwór jest trwały przez 3 tygodnie w temperaturze +4°C). Poziom GSH mierzono przy 420 nm (5).

4. Oznaczanie enzymów antyoksydacyjnych (SOD, CAT)

Wyizolowane krwinki czerwone przemyto trzykrotnie trzema objętościami lodowatego 0,9 mmol/l NaCl, a do oznaczenia aktywności CAT użyto hemolizatów zawierających około 50 g Hb/l. Bufor CAT, przygotowaną próbkę hemolizatu i 10 mM H2O2 zastosowano do oznaczenia CAT. Detekcję przeprowadzono przy 360 nm. Aktywność SOD określono metodą epinefryny. Hemolizat zmieszano z buforem węglanowym, a następnie dodano epinefrynę. Detekcję przeprowadzono przy 470 nm (6-10).

Ocena stanu zapalnego W celu oceny stanu zapalnego pacjentów w obu punktach zainteresowania (doba 0 i 30) mierzono następujące parametry: stężenie białka C-reaktywnego w surowicy - CRP oraz stężenie czynnika martwicy nowotworów - TNF-α.

Stężenie białka C-reaktywnego (CRP) w surowicy oznaczano metodą turbidymetryczną na aparacie Olympus AU680. Prawidłowe stężenie CRP w surowicy wynosi ≤ 5 mg/l. Mikrozapalenie definiuje się jako stężenie CRP w surowicy na poziomie 5 mg/l.

Stężenia TNF-α w osoczu określono za pomocą testu immunoadsorpcji enzymatycznej (ELISA) przy użyciu dostępnego w handlu pośredniego testu immunoenzymatycznego typu kanapkowego o wysokiej czułości (Sigma Aldrich).

Ocena parametrów hematologicznych

W obu punktach zainteresowania analizowano wartości następujących parametrów hematologicznych u wszystkich pacjentów:

Erytrocyty (Er), hemoglobina (Hb), hematokryt (Hct), wskaźnik erytrocytów – średnia objętość krwinki (MCV), średnia hemoglobina w krwince (MCH), średnie stężenie hemoglobiny w krwince (MCHC), stężenie dehydrogenazy mleczanowej w surowicy (LDH), haptoglobina w surowicy stężenie i stan żelaza: stężenie żelaza w surowicy, ferrytyna; całkowita zdolność wiązania żelaza (TIBC), zdolność wiązania żelaza nienasyconego (UIBC), wysycenie transferyny (TSAT), haptoglobina.