Gli effetti del consumo di un mese di estratto standardizzato di Aronia Melanocarpa sull'anemia nei pazienti in emodialisi

Valutazione dei campioni di plasma allo stato redox sistemico sono stati utilizzati per la determinazione dei livelli dei seguenti pro-ossidanti: anione radicale superossido (O2-), perossido di idrogeno (H2O2), nitriti (NO2-) e indice di perossidazione lipidica misurato come acido tiobarbiturico reattivo (TBARS), mentre i parametri del sistema di difesa antiossidante, come le attività della superossido dismutasi (SOD) e della catalasi (CAT) e il livello di glutatione ridotto (GSH) sono stati determinati nei campioni di lisati di eritrociti.

A) Determinazione dell'indice di perossidazione lipidica (TBARS) Il grado di perossidazione lipidica nei campioni di plasma è stato stimato misurando il TBARS, utilizzando acido tiobarbiturico all'1% in NaOH 0,05, che è stato incubato con il campione a 100°C per 15 minuti e misurato a 530nm. L'estratto di TBA è stato ottenuto combinando 0,8 ml di campione e 0,4 ml di acido tricloroacetico (TCA); successivamente i campioni sono stati posti in ghiaccio per 10 min e centrifugati per 15 min a 6000 rpm. (1).

b) Determinazione dei nitriti (NO2-)

L'ossido nitrico (NO) si decompone rapidamente per formare prodotti nitriti/nitrati stabili. Il livello di NO2 è stato misurato e utilizzato come indice della produzione di NO, utilizzando il reagente di Griess. Per la determinazione di NO2 nel plasma 0,1 ml di 3 N PCA (acido percloruro), 0,4 ml di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 20 mM e 0,2 ml di plasma sono stati messi in ghiaccio per 15 minuti, quindi centrifugati per 15 minuti a 6000 rpm. Dopo aver eliminato il surnatante, sono stati aggiunti 220 μl di K2CO3. I nitriti sono stati misurati a 550 nm. (2)

1. Determinazione del radicale dell'anione superossido (O2-)

   Le concentrazioni di radicali di anioni superossido nei campioni di plasma sono state misurate utilizzando il reagente NTB (Nitro Blue Tetrazolio) in tampone TRIS (miscela di analisi). La misura è stata eseguita ad una lunghezza d'onda di 530 nm. (3).

2. Determinazione del perossido di idrogeno (H2O2)

   La misurazione di H2O2 era basata sull'ossidazione del rosso fenolo da parte di H2O2 in una reazione catalizzata dalla perossidasi di rafano. Duecento microlitri di perfusato o plasma sono stati precipitati utilizzando 800 mL di soluzione di rosso fenolo appena preparata; Successivamente sono stati aggiunti 10 μL di (1:20) perossidasi di rafano (prodotta immediatamente prima dell'uso). Il livello di H2O2 è stato misurato a 610 nm (4).

3. Determinazione del glutatione ridotto (GSH)

   Il livello di glutatione ridotto (GSH) è stato determinato in base all'ossidazione del GSH tramite acido 5,5-ditiobis-6,2-nitrobenzoico. L'estratto di GSH è stato ottenuto combinando 0,1 ml di EDTA allo 0,1%, 400 μl di emolisato e 750 μl di soluzione di precipitazione (contenente 1,67 g di acido metafosforico, 0,2 g di EDTA, 30 g di NaCl e riempita con acqua distillata fino a 100 ml; la soluzione è stabile per 3 settimane a +4C°). Il livello di GSH è stato misurato a 420 nm (5).

4. Determinazione degli enzimi antiossidanti (SOD, CAT)

I globuli rossi isolati sono stati lavati tre volte con tre volumi di NaCl ghiacciato 0,9 mmol/l e per la determinazione dell'attività CAT sono stati utilizzati emolisati contenenti circa 50 g Hb/l. Tampone CAT, campione di emolisato preparato e H2O2 10 mM sono stati utilizzati per la determinazione CAT. Il rilevamento è stato eseguito a 360 nm. L'attività della SOD è stata determinata con il metodo dell'epinefrina. L'emolisato è stato miscelato con tampone carbonato, quindi è stata aggiunta epinefrina. Il rilevamento è stato eseguito a 470 nm (6-10).

Valutazione dello stato infiammatorio Al fine di valutare lo stato infiammatorio dei pazienti, sono stati misurati i seguenti parametri in entrambi i punti di interesse (0 e 30° giorno): concentrazione sierica di proteina C-reattiva - CRP e concentrazione di fattore di necrosi tumorale - TNF-α.

La concentrazione sierica della proteina C-reattiva (CRP) è stata determinata con il metodo turbidimetrico sull'Olympus AU680. La normale concentrazione sierica di PCR è ≤ 5 mg/L. La microinfiammazione è definita come la concentrazione di CRP nel siero di 5 mg/L.

Le concentrazioni plasmatiche di TNF-α sono state determinate mediante test immunoadsorbente legato all'enzima (ELISA) utilizzando il test immunoassorbente legato all'enzima sandwich indiretto ad alta sensibilità disponibile in commercio (Sigma Aldrich).

Valutazione dei parametri ematologici

In entrambi i punti di interesse sono stati analizzati i valori dei seguenti parametri ematologici in tutti i pazienti:

Eritrociti (Er), emoglobina (Hb), ematocrito (Hct), indice eritrocitario - volume corpuscolare medio (MCV), emoglobina corpuscolare media (MCH), concentrazione emoglobinica corpuscolare media (MCHC), concentrazione sierica di lattato deidrogenasi (LDH), aptoglobina sierica concentrazione e stato del ferro: concentrazione sierica di ferro, ferritina; capacità legante il ferro totale (TIBC), capacità legante il ferro insaturo (UIBC), saturazione della transferrina (TSAT), aptoglobina.