Die Auswirkungen eines einmonatigen Konsums von standardisiertem Aronia Melanocarpa-Extrakt auf Anämie bei Hämodialysepatienten

Bewertung des systemischen Redoxzustands Plasmaproben wurden zur Bestimmung der Konzentrationen der folgenden Prooxidantien verwendet: Superoxid-Anion-Radikal (O2-), Wasserstoffperoxid (H2O2), Nitrite (NO2-) und Index der Lipidperoxidation, gemessen als Thiobarbitursäure-reaktiv Substanzen (TBARS), während die Parameter des antioxidativen Abwehrsystems, wie Aktivitäten der Superoxiddismutase (SOD) und Katalase (CAT) und der Gehalt an reduziertem Glutathion (GSH) in Erythrozytenlysatproben bestimmt wurden.

A) Bestimmung des Lipidperoxidationsindex (TBARS) Der Grad der Lipidperoxidation in den Plasmaproben wurde durch Messen von TBARS abgeschätzt, wobei 1 % Thiobarbitursäure in 0,05 NaOH verwendet wurde, die mit der Probe 15 min bei 100°C inkubiert und bei gemessen wurde 530 Nanometer. TBA-Extrakt wurde durch Kombinieren von 0,8 ml Probe und 0,4 ml Trichloressigsäure (TCA) erhalten; danach wurden die Proben für 10 min auf Eis gelegt und für 15 min bei 6000 rpm zentrifugiert. (1).

b) Nitritbestimmung (NO2-)

Stickoxid (NO) zersetzt sich schnell zu stabilen Nitrit/Nitrat-Produkten. Der NO2-Gehalt wurde gemessen und als Index der NO-Produktion verwendet, wobei das Griess-Reagenz verwendet wurde. Für die NO2-Bestimmung im Plasma wurden 0,1 ml 3 N PCA (Perchlorsäure), 0,4 ml 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,2 ml Plasma 15 min auf Eis gestellt, dann 15 min bei 6000 U/min zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstandes wurden 220 µl K2CO3 zugegeben. Nitrite wurden bei 550 nm gemessen. (2)

1. Superoxid-Anion-Radikalbestimmung (O2-)

   Die Konzentrationen von Superoxid-Anion-Radikalen in Plasmaproben wurden unter Verwendung des NTB (Nitroblau-Tetrazolium)-Reagens in TRIS-Puffer (Assay-Mischung) gemessen. Die Messung wurde bei einer Wellenlänge von 530 nm durchgeführt. (3).

2. Wasserstoffperoxidbestimmung (H2O2)

   Die Messung von H2O2 basierte auf der Oxidation von Phenolrot durch H2O2 in einer durch Meerrettichperoxidase katalysierten Reaktion. 200 Mikroliter Perfusat oder Plasma wurden unter Verwendung von 800 ml frisch hergestellter Phenolrotlösung ausgefällt; Anschließend wurden 10 μL (1:20) Meerrettichperoxidase (hergestellt unmittelbar vor Gebrauch) zugegeben. Der H2O2-Pegel wurde bei 610 nm gemessen (4).

3. Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH)

   Der Gehalt an reduziertem Glutathion (GSH) wurde basierend auf der GSH-Oxidation über 5,5-Dithiobis-6,2-Nitrobenzoesäure bestimmt. GSH-Extrakt wurde erhalten, indem 0,1 ml 0,1 % EDTA, 400 μl Hämolysat und 750 μl Fällungslösung (enthaltend 1,67 g Metaphosphorsäure, 0,2 g EDTA, 30 g NaCl) vereinigt und mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt wurden; die Lösung ist stabil für 3 Wochen bei +4C°). Der GSH-Spiegel wurde bei 420 nm gemessen (5).

4. Bestimmung antioxidativer Enzyme (SOD, CAT)

Isolierte Erythrozyten wurden dreimal mit drei Volumina eiskalter 0,9 mmol/l NaCl gewaschen und Hämolysate mit etwa 50 g Hb/l wurden zur Bestimmung der CAT-Aktivität verwendet. Für die CAT-Bestimmung wurden CAT-Puffer, eine vorbereitete Hämolysatprobe und 10 mM H2O2 verwendet. Die Detektion wurde bei 360 nm durchgeführt. Die SOD-Aktivität wurde durch das Epinephrin-Verfahren bestimmt. Hämolysat wurde mit Carbonatpuffer gemischt und dann Epinephrin zugegeben. Die Detektion wurde bei 470 nm (6-10) durchgeführt.

Bewertung des Entzündungsstatus Um den Entzündungsstatus der Patienten zu bewerten, wurden die folgenden Parameter an beiden Points of Interest (0. und 30. Tag) gemessen: C-reaktive Proteinkonzentration im Serum – CRP und Tumornekrosefaktorkonzentration – TNF-α.

Die Konzentration des C-reaktiven Proteins (CRP) im Serum wurde durch die turbidimetrische Methode auf dem Olympus AU680 bestimmt. Die normale Serum-CRP-Konzentration beträgt ≤ 5 mg/l. Eine Mikroentzündung ist definiert als eine CRP-Konzentration im Serum von 5 mg/l.

Die Plasma-TNF-&agr;-Konzentrationen wurden durch einen enzymgebundenen Immunadsorptionstest (ELISA) unter Verwendung eines im Handel erhältlichen hochempfindlichen indirekten enzymgebundenen Sandwich-Immunadsorptionstests (Sigma Aldrich) bestimmt.

Auswertung der hämatologischen Parameter

An beiden interessierenden Punkten wurden die Werte der folgenden hämatologischen Parameter bei allen Patienten analysiert:

Erythrozyten (Er), Hämoglobin (Hb), Hämatokrit (Hct), Erythrozytenindex – mittleres korpuskuläres Volumen (MCV), mittleres korpuskuläres Hämoglobin (MCH), mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC), Serum-Lactatdehydrogenase-Konzentration (LDH), Serum-Haptoglobin Konzentration und Eisenstatus: Serumeisenkonzentration, Ferritin; Gesamteisenbindungskapazität (TIBC), ungesättigte Eisenbindungskapazität (UIBC), Transferrinsättigung (TSAT), Haptoglobin.