Imunohistochemické hodnocení ligand1 a LC3B programované smrti v GBM

Gliomy tvoří téměř 30 % všech primárních mozkových nádorů a jsou zodpovědné za většinu úmrtí na primární mozkové nádory.

Glioblastom je nejčastější primární maligní nádor mozku u dospělých, tvoří 60–70 % gliomů a 15 % primárních mozkových nádorů. Glioblastom je nejagresivnější a nediferencovaný typ gliomu a je označen WHO stupněm IV.

Programovaná buněčná smrt 1 (PD-1) je proteinový receptor, který funguje jako imunitní kontrolní bod. Přenáší inhibiční signál do T buněk. U rakoviny chrání nádory před cytotoxickými T lymfocyty (CTL). Inter¬akce PD1 s jeho ligandem PD-L1 na povrchu T-buněk potlačuje jejich funkci a brání rozpoznání nádorových buněk. Exprese PD-L1 nepřímo koreluje s hustotou intratumorálních CD8+ (Cluster of Differentiation 8) T buněk .

Autofagie je katabolický proces, který vede k buněčné degradaci a recyklaci lysozomálním trávením. To umožňuje buňkám přizpůsobit se stresu). Autofagie podporuje vývoj nádoru, progresi a odolnost vůči terapii díky své roli pro přežití ve stresu jako ozařování a chemoterapie. LC3B (proteinový lehký řetězec spojený s mikrotubuly 3 B) je běžně používaný marker pro monitorování autofagie. PD-L1 souvisí s autofagií. Nedávné poznatky z experimentů s buňkami myšího melanomu a lidskými buňkami rakoviny vaječníků ukázaly, že buňky exprimující vysoké hladiny PD-L1 jsou citlivější k inhibitorům autofagie než buňky, které slabě exprimují PD-L1. Toto zjištění poskytuje potenciální příležitosti pro použití autofagických inhibitorů v buňkách nadměrně exprimujících PD-L1 jako novou cestu v léčbě rakoviny. Naše studie tedy nebyla studována v GBM dříve, je čistě nová studie.

Autoři předpokládají, že jak PD-L1, tak LC3B jsou vysoce exprimovány v GBM buňkách a vysoká exprese PDL1 je spojena s nízkým počtem CTL. Je možné, že zvýšené hladiny markerů PD-L1 a LC3B indikují imunitní inhibici, zvýšenou autofagii a špatnou prognózu, takže jejich inhibice bude mít terapeutický přínos.

Tato hypotéza nebyla dosud podle našich nejlepších znalostí plně ověřena zejména na naší lokalitě. Abychom prozkoumali naši hypotézu, je tato práce uspořádána do tří konkrétních cílů:

1. Vyhodnotit vztah mezi expresí PD-L1 a počtem CTL v GBM.
2. Vyhodnotit expresi PDL-1 a LC3B v GBM a posoudit jejich vztah.
3. Prozkoumat prognostickou relevanci PDL-1 a LC3B v GBM přirovnáním úrovně jejich exprese k některým zavedeným prognostickým faktorům (věk pacienta, multifokální nádor, totální nebo subtotální excize, opětovný růst nádoru, karnofského výkonnostní skóre a histopatologické rysy jako: nekróza) .

Formalínem fixované a parafínové zalité tkáňové vzorky asi šedesáti jedna případů GBM a blízké zjevně normální mozkové tkáně budou získány ze soukromé laboratoře.

Bude přezkoumána histologická diagnostika řezů barvených H&E a budou posouzena histologická prognostická kritéria.

Jako vizualizační metoda bude použito imunohistochemické barvení na PDL-1,CD8 a LC3B pomocí myších monoklonálních protilátek s imunoperoxidázovým barvením. Ředění protilátek, metody získávání antigenu a inkubační doba budou všechny prováděny podle pokynů výrobce.

Výpočet velikosti vzorku byl proveden pomocí softwaru G*Power 3. Vypočtený vzorek 61 pacientů s glioblastomem bude potřeba k detekci velikosti účinku 0,1 (HR se pohybovala mezi 1,54 a 1,74 v multivariační Coxově proporční regresi rizika pro úroveň exprese PD-L1), s pravděpodobností chyby 0,05 a 80% mocninou v jednostranném testu.

Korelace mezi PD-L1, počtem CTL a expresí LC3B a prognostickými kritérii GBM bude provedena pomocí počítačového softwaru SPSS (Statistical Package for Social Sciences).