Srovnání molekulárně-genetické shody primárního nádoru a mozkových metastáz gastroezofageálních karcinomů (GENCONCOR-2)

Malignity jícnu, gastroezofageální junkce a žaludku, souhrnně označované jako gastroezofageální karcinomy, představují významný podíl na celosvětové incidenci a mortalitě nádorových onemocnění. Vývoj mozkových metastáz (BM) u těchto pacientů, dříve považovaný za extrémně vzácnou událost s incidencí odhadovanou na méně než 1–2 % v časných kazuistikách, je nyní rozpoznáván stále častěji. Toto zvýšení frekvence je z velké části připisováno pokrokům v systémové terapii, které vedly ke zlepšené kontrole mimolebního onemocnění a prodloužení přežití pacientů, stejně jako ke zlepšené neurozobrazovací diagnostice, která zvýšila detekci dříve asymptomatických lézí, čímž odhalila mozek jako časté útočiště pro metastatické šíření.

Navzdory tomuto rostoucímu uznání zůstává molekulárně-genetická charakteristika BM z gastroezofageálních karcinomů kriticky nedostatečně prostudována, s omezenými údaji o klíčových prediktivních biomarkerech, jako jsou HER2, MSI, PD-L1 a CLDN18.2, ve spárovaných vzorcích primárních nádorů a metastáz. Prognóza pacientů s mozkovými metastázami gastroezofageálního karcinomu se však v posledních desetiletích nezlepšila, medián přežití se stále měří v měsících.

Pro vyplnění této kritické mezery ve znalostech jsme dříve zahájili mezinárodní studii GASTROBRAIN (ClinicalTrials.gov ID: NCT07448493), která vytvořila rozsáhlou multicentrickou retrospektivní kohortu více než 230 pacientů s mozkovými metastázami z karcinomu žaludku a jícnu s komplexními klinicko-patologickými a léčebnými údaji. Jako další krok jsme systematicky identifikovali, shromáždili a centralizovali archivní histologický materiál od pacientů s dostupnými spárovanými vzorky tkáně primárního nádoru a odpovídající BM fixovanými v paraffinu (FFPE) pro translacionální studii GENCONCOR-2. Toto vnořené schéma umožní robustní vyšetření shody statusu HER2, MSI, PD-L1 (CPS) a CLDN18.2 ve spárovaných nádorech – analýzu, která, pokud je nám známo, dosud nebyla publikována.

Vyhodnocení biomarkerů

1. Status HER2 bude hodnocen imunohistochemicky (IHC) s použitím protilátkového klonu SP3 (DAKO) na platformě Ventana GX s detekčním systémem Ventana OptiView. Výsledky budou vyhodnoceny podle směrnic ASCO-CAP. U vzorků adenokarcinomu žaludku, gastroezofageální junkce a jícnu bude skórování HER2 IHC následovat modifikovaná kritéria stanovená pro nádory horní části gastrointestinálního traktu. Pro chirurgické vzorky je pozitivita 3+ definována jako silné úplné, bazolaterální nebo laterální membránové barvení v ≥ 10 % nádorových buněk; pro bioptické vzorky je silné membránové barvení v shluku alespoň 5 nádorových buněk považováno za pozitivní bez ohledu na procento obarvených nádorových buněk. Případy s IHC 2+ (slabé až středně silné úplné, bazolaterální nebo laterální membránové barvení v ≥ 10 % nádorových buněk pro chirurgické vzorky, nebo v shluku nádorových buněk pro biopsie) budou považovány za nejednoznačné a podstoupí hodnocení počtu kopií genu HER2 metodou in situ hybridizace (ISH), včetně FISH, CISH nebo SISH. Pozitivita HER2 metodou ISH bude definována jako poměr HER2/CEP17 ≥ 2,0; nebo, pokud je poměr < 2,0, průměrný počet kopií genu HER2 ≥ 6,0 signálů na buňku. Případy s IHC 2+ a poměrem HER2/CEP17 < 2,0 s průměrným počtem kopií genu HER2 mezi ≥ 4,0 a < 6,0 signály na buňku budou považovány za neurčité. V takových neurčitých případech bude konzultován druhý hodnotitel a může být zváženo přetestování na dalším nádorovém materiálu.
2. Status PD-L1 bude hodnocen IHC s použitím protilátkového klonu DAKO 22C3 na platformě Dako Link48 s detekčním systémem Dako EnVision Flex. Externí pozitivní kontrola bude tkáň mandlí. Výsledky budou vyhodnoceny podle doporučení výrobce testovacího systému. Exprese PD-L1 bude vyjádřena jako kombinované pozitivní skóre (CPS), definované jako počet PD-L1 obarvených buněk (nádorové buňky, lymfocyty, makrofágy) dělený celkovým počtem životaschopných nádorových buněk, vynásobený 100.
3. Status MSI bude stanoven IHC nebo PCR. Pro ICH hodnocení bude hodnocena ztráta exprese proteinů opravy chybných párů bází (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2). Pro PCR analýzu bude mikrosatelitová nestabilita hodnocena pomocí pěti mononukleotidových repetitivních markerů (BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27).
4. Exprese CLDN18.2 bude hodnocena IHC s použitím testu VENTANA CLDN18 (43-14A) na platformě Ventana. Pozitivní exprese bude definována jako středně silné až silné (2+/3+) úplné, bazolaterální nebo laterální membránové barvení v ≥ 75 % životaschopných nádorových buněk, v souladu s ustavenými kritérii z klinických studií a současných klinických doporučení. Tento práh bude jednotně aplikován na všechny vzorky, včetně primárních nádorů i mozkových metastáz, od pacientů s adenokarcinomy žaludku, gastroezofageální junkce a jícnu.
5. Pokud budou k dispozici finanční prostředky, bude na spárovaných nádorových vzorcích provedeno exploratorní sekvenování nové generace (NGS) k identifikaci dalších genomových alterací a vyšetření jejich shody mezi primárními nádory a mozkovými metastázami.

Primárním cílem této studie je vyhodnotit v rozsáhlé reálné kohortě celkovou molekulární diskordanci (%) mezi primárními gastroezofageálními karcinomy a jejich spárovanými mozkovými metastázami – definovanou jako podíl případů s diskordantním statusem biomarkeru vzhledem k celkovému počtu analyzovaných spárovaných vzorků. Kromě celkové míry diskordance bude míra diskordance (%) analyzována samostatně pro každý biomarker (HER2, MSI, PD-L1 (CPS) a CLDN18.2). Sekundární koncové body zahrnují:

1. Celkové přežití (OS): Definováno jako čas od data diagnózy mozkové metastázy (BM) do data úmrtí z jakékoli příčiny nebo posledního sledování (cenzorováno).

2. Čas do intrakraniální progrese (TTIP): Definován jako čas od data počáteční diagnózy karcinomu žaludku a jícnu do data první detekce BM. Na základě tohoto intervalu budou pacienti kategorizováni do dvou skupin:

   • Synchronní BM: BM diagnostikované před diagnózou primárního nádoru nebo do 2 měsíců (≤ 60 dnů) od diagnózy primárního nádoru.
   • Metachronní BM: BM diagnostikované více než 2 měsíce (> 60 dnů) po diagnóze primárního nádoru.

3. Progrese bez přežití centrálního nervového systému (CNS-PFS): Definováno jako čas od data první lokální léčby BM do data následné intrakraniální progrese nebo posledního instrumentálního sledování (cenzorováno). Následná intrakraniální progrese zahrnuje:

   • Pokračující růst léčené léze (≤ 6 měsíců od léčby);
   • Lokální recidivu léčené léze (> 6 měsíců od léčby);
   • Vznik nových vzdálených intrakraniálních lézí. Exploratorní cíl: V závislosti na dostupnosti financování bude na spárovaných vzorcích provedeno sekvenování nové generace (NGS) k prozkoumání shody širšího panelu genomových alterací mezi primárními nádory a jejich spárovanými mozkovými metastázami.

Statistická analýza. Všechny statistické analýzy budou provedeny pomocí IBM SPSS Statistics (verze 29.0) a STATA (verze 17.0, StataCorp LLC). Oboustranná p-hodnota < 0,05 bude považována za statisticky významnou.

• Deskriptivní statistika. Kategorické proměnné budou prezentovány jako absolutní četnosti (n) a relativní četnosti (%). Spojité proměnné budou hodnoceny na normalitu. Normálně rozdělené proměnné budou prezentovány jako průměr se směrodatnou odchylkou (SD); nenormálně rozdělené proměnné budou prezentovány jako medián s interkvartilovým rozsahem (IQR). Četnost chybějících údajů bude uvedena pro všechny proměnné.
• Analýza diskordance a shody. Primárním koncovým bodem je celková molekulární diskordance (%) – definovaná jako podíl případů s diskordantním statusem biomarkeru mezi primárním nádorem a jeho spárovanou mozkovou metastázou vzhledem k celkovému počtu analyzovaných spárovaných vzorků. Kromě celkové míry diskordance bude míra diskordance (%) analyzována samostatně pro každý biomarker (HER2, MSI, PD-L1 (CPS) a CLDN18.2). Dále bude shoda hodnocena pomocí celkového procentuálního souhlasu a Cohenova kappa koeficientu (κ) s 95% intervaly spolehlivosti. Hodnoty kappa budou interpretovány následovně: ≤ 0 = špatná shoda, 0,01–0,20 = nepatrná shoda, 0,21–0,40 = střední shoda, 0,41–0,60 = mírná shoda, 0,61–0,80 = podstatná shoda a 0,81–1,00 = téměř dokonalá shoda.
• Analýza přežití. Křivky přežití budou odhadnuty pomocí Kaplan-Meierovy metody. Bude uveden medián přežití s 95% intervaly spolehlivosti (CI). Porovnání křivek přežití mezi skupinami (např. shodné vs. neshodné případy, biomarker-pozitivní vs. biomarker-negativní) bude provedeno pomocí log-rank testu.
• Univariační a multivariační analýza. Bude provedena univariační Coxova regrese proporcionálních rizik k identifikaci potenciálních prognostických faktorů asociovaných s výsledky přežití (OS, CNS-PFS). Proměnné s p < 0,10 v univariační analýze, stejně jako klinicky relevantní faktory bez ohledu na významnost, budou zahrnuty do multivariačních Coxových regresních modelů proporcionálních rizik k identifikaci nezávislých prognostických faktorů. Předpoklad proporcionálních rizik bude testován. Výsledky budou prezentovány jako poměry rizik (HR) s 95% CI.
• Asociace s klinicko-patologickými údaji. Status biomarkerů a vzorce diskordance budou korelovány s klinicko-patologickými proměnnými a léčebnými modalitami pomocí chi-kvadrát testu nebo Fisherova exaktního testu pro kategorické proměnné a t-testu nebo Mann-Whitneyho U testu pro spojité proměnné, podle vhodnosti. Tyto analýzy využijí komplexní klinicko-patologickou databázi založenou v rámci mateřské kohorty GASTROBRAIN.
• Zpracování chybějících údajů. Podíl chybějících údajů bude uveden pro všechny proměnné. Budou prozkoumány vzorce chybějících údajů. Vzhledem k podpůrné povaze této translacionální studie budou do této analýzy zahrnuty pouze případy s kompletními spárovanými údaji biomarkerů.