Confronto della concordanza molecolare-genetica del tumore primario e delle metastasi cerebrali nei tumori gastroesofagei (GENCONCOR-2)

I tumori maligni dell'esofago, della giunzione gastroesofagea e dello stomaco, collettivamente indicati come tumori gastroesofagei, rappresentano una proporzione sostanziale dell'incidenza e della mortalità per cancro a livello globale. Lo sviluppo di metastasi cerebrali (MC) in questi pazienti, un tempo considerato un evento estremamente raro con incidenze stimate inferiori all'1-2% nelle prime serie di casi, è ora riconosciuto con frequenza crescente. Questa crescente frequenza è in gran parte attribuita ai progressi della terapia sistemica, che hanno portato a un migliore controllo della malattia extracranica e a una sopravvivenza prolungata dei pazienti, nonché al miglioramento della neuroimaging, che ha aumentato il rilevamento di lesioni precedentemente asintomatiche, svelando così il cervello come un comune sito santuario per la diffusione metastatica.

Nonostante questo crescente riconoscimento, il panorama molecolare-genetico delle MC da tumori gastroesofagei rimane criticamente poco studiato, con dati limitati su biomarcatori predittivi chiave come HER2, MSI, PD-L1 e CLDN18.2 in campioni primari e metastatici appaiati. Tuttavia, la prognosi per i pazienti con metastasi cerebrali da tumore gastroesofageo non è migliorata negli ultimi decenni, con una sopravvivenza mediana ancora misurata in mesi.

Per colmare questa lacuna di conoscenza critica, abbiamo precedentemente avviato lo studio internazionale GASTROBRAIN (ClinicalTrials.gov ID: NCT07448493), che ha stabilito una vasta coorte retrospettiva multi-istituzionale di oltre 230 pazienti con metastasi cerebrali da cancro gastrico ed esofageo, con dati clinicopatologici e terapeutici completi. Come passo successivo, abbiamo identificato, raccolto e centralizzato sistematicamente materiale istologico d'archivio da pazienti con campioni di tessuto disponibili appaiati in formalina fissati e inclusi in paraffina (FFPE) del tumore primario e della corrispondente MC per lo studio traslazionale GENCONCOR-2. Questo disegno annidato consentirà un'indagine robusta sulla concordanza dello stato di HER2, MSI, PD-L1 (CPS) e CLDN18.2 in coppie tumorali appaiate - un'analisi che, a nostra conoscenza, non è stata precedentemente riportata.

Valutazione dei Biomarcatori

1. Lo stato di HER2 sarà valutato mediante immunoistochimica (IHC) utilizzando il clone anticorpale SP3 (DAKO) sulla piattaforma Ventana GX con il sistema di rilevamento Ventana OptiView. I risultati saranno valutati secondo le linee guida ASCO-CAP. Per i campioni di adenocarcinoma gastrico, gastroesofageo ed esofageo, lo scoring IHC per HER2 seguirà i criteri modificati stabiliti per i tumori del tratto gastrointestinale superiore. Per i campioni chirurgici, la positività 3+ è definita come colorazione membranosa completa, basolaterale o laterale forte in ≥ 10% delle cellule tumorali; per i campioni bioptici, la colorazione membranosa forte in un cluster di almeno 5 cellule tumorali è considerata positiva indipendentemente dalla percentuale di cellule tumorali colorate. I casi con IHC 2+ (colorazione membranosa completa, basolaterale o laterale da debole a moderata in ≥ 10% delle cellule tumorali per i campioni chirurgici, o in un cluster di cellule tumorali per le biopsie) saranno considerati equivoci e saranno sottoposti a valutazione del numero di copie del gene HER2 mediante ibridazione in situ (ISH), inclusi FISH, CISH o SISH. La positività per HER2 mediante ISH sarà definita come un rapporto HER2/CEP17 ≥ 2.0; oppure, se il rapporto è < 2.0, un numero medio di copie del gene HER2 ≥ 6.0 segnali per cellula. I casi con IHC 2+ e un rapporto HER2/CEP17 < 2.0 con un numero medio di copie del gene HER2 tra ≥ 4.0 e < 6.0 segnali per cellula saranno considerati indeterminati. In tali casi indeterminati, sarà consultato un secondo revisore e potrebbe essere considerato un nuovo test su ulteriore materiale tumorale.
2. Lo stato di PD-L1 sarà valutato mediante IHC utilizzando il clone anticorpale DAKO 22C3 sulla piattaforma Dako Link48 con il sistema di rilevamento Dako EnVision Flex. Il controllo positivo esterno sarà tessuto tonsillare. I risultati saranno valutati secondo le raccomandazioni del produttore del sistema di test. L'espressione di PD-L1 sarà riportata come Combined Positive Score (CPS), definito come il numero di cellule colorate per PD-L1 (cellule tumorali, linfociti, macrofagi) diviso per il numero totale di cellule tumorali vitali, moltiplicato per 100.
3. Lo stato di MSI sarà determinato mediante IHC o PCR. Per la valutazione IHC, sarà valutata la perdita di espressione delle proteine di riparazione degli appaiamenti errati (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2). Per l'analisi basata su PCR, l'instabilità dei microsatelliti sarà valutata utilizzando cinque marcatori mononucleotidici ripetuti (BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27).
4. L'espressione di CLDN18.2 sarà valutata mediante IHC utilizzando il test VENTANA CLDN18 (43-14A) sulla piattaforma Ventana. L'espressione positiva sarà definita come colorazione membranosa completa, basolaterale o laterale da moderata a forte (2+/3+) in ≥ 75% delle cellule tumorali vitali, in accordo con i criteri stabiliti dagli studi clinici e dalle attuali linee guida cliniche. Questa soglia sarà applicata uniformemente a tutti i campioni, inclusi sia i tumori primari che le metastasi cerebrali, da pazienti con adenocarcinomi gastrici, della giunzione gastroesofagea ed esofagei.
5. Se saranno disponibili fondi, sarà eseguito il sequenziamento di nuova generazione (NGS) esplorativo su campioni tumorali appaiati per identificare ulteriori alterazioni genomiche e indagare la loro concordanza tra tumori primari e metastasi cerebrali.

L'obiettivo primario di questo studio è valutare, in una vasta coorte del mondo reale, il tasso complessivo di discordanza molecolare (%) tra i tumori gastroesofagei primari e le loro metastasi cerebrali appaiate - definito come la proporzione di casi con stato del biomarcatore discordante rispetto al numero totale di campioni appaiati analizzati. Oltre al tasso di discordanza complessivo, il tasso di discordanza (%) sarà analizzato separatamente per ciascun biomarcatore (HER2, MSI, PD-L1 (CPS) e CLDN18.2). Gli endpoint secondari includono:

1. Sopravvivenza Globale (OS): Definita come il tempo dalla data della diagnosi di metastasi cerebrale (MC) alla data di morte per qualsiasi causa o all'ultimo follow-up (censurato).

2. Tempo alla Progressione Intracranica (TTIP): Definito come il tempo dalla data della diagnosi iniziale di cancro gastrico ed esofageo alla data della prima rilevazione di MC. Sulla base di questo intervallo, i pazienti saranno categorizzati in due gruppi:

   • MC Sincrone: MC diagnosticate prima o entro 2 mesi (≤ 60 giorni) dalla diagnosi del tumore primario.
   • MC Metacrone: MC diagnosticate più di 2 mesi (> 60 giorni) dopo la diagnosi del tumore primario.

3. Sopravvivenza Libera da Progressione del Sistema Nervoso Centrale (CNS-PFS): Definita come il tempo dalla data del primo trattamento locale per MC alla data della successiva progressione intracranica o dell'ultimo follow-up strumentale (censurato). La successiva progressione intracranica include:

   • Crescita continua della lesione trattata (≤ 6 mesi da essa);
   • Recidiva locale della lesione trattata (> 6 mesi da essa);
   • Sviluppo di nuove lesioni intracraniche distanti. Obiettivo esplorativo: In base alla disponibilità di fondi, sarà eseguito il sequenziamento di nuova generazione (NGS) su campioni appaiati per esplorare la concordanza di un pannello più ampio di alterazioni genomiche tra tumori primari e le loro metastasi cerebrali appaiate.

Analisi Statistica. Tutte le analisi statistiche saranno eseguite utilizzando IBM SPSS Statistics (versione 29.0) e STATA (versione 17.0, StataCorp LLC). Un valore p bilaterale < 0.05 sarà considerato statisticamente significativo.

• Statistiche Descrittive. Le variabili categoriche saranno presentate come frequenze assolute (n) e frequenze relative (%). Le variabili continue saranno valutate per la normalità. Le variabili distribuite normalmente saranno presentate come media con deviazione standard (DS); le variabili non distribuite normalmente saranno presentate come mediana con intervallo interquartile (IQR). La frequenza dei dati mancanti sarà riportata per tutte le variabili.
• Analisi di Discordanza e Concordanza. L'endpoint primario è il tasso complessivo di discordanza molecolare (%) - definito come la proporzione di casi con stato del biomarcatore discordante tra il tumore primario e la sua metastasi cerebrale appaiata rispetto al numero totale di campioni appaiati analizzati. Oltre al tasso di discordanza complessivo, il tasso di discordanza (%) sarà analizzato separatamente per ciascun biomarcatore (HER2, MSI, PD-L1 (CPS) e CLDN18.2). Inoltre, la concordanza sarà valutata utilizzando l'accordo percentuale complessivo e il coefficiente kappa di Cohen (κ) con intervalli di confidenza al 95%. I valori kappa saranno interpretati come segue: ≤ 0 = accordo scarso, 0.01-0.20 = accordo leggero, 0.21-0.40 = accordo discreto, 0.41-0.60 = accordo moderato, 0.61-0.80 = accordo sostanziale e 0.81-1.00 = accordo quasi perfetto.
• Analisi di Sopravvivenza. Le curve di sopravvivenza saranno stimate utilizzando il metodo di Kaplan-Meier. I tempi di sopravvivenza mediana con intervalli di confidenza (IC) al 95% saranno riportati. Il confronto delle curve di sopravvivenza tra gruppi (ad es., casi concordanti vs. discordanti, biomarker-positivi vs. biomarker-negativi) sarà eseguito utilizzando il test del log-rank.
• Analisi Univariata e Multivariata. Sarà eseguita la regressione dei rischi proporzionali di Cox univariata per identificare potenziali fattori prognostici associati agli esiti di sopravvivenza (OS, CNS-PFS). Le variabili con p < 0.10 nell'analisi univariata, nonché fattori clinicamente rilevanti indipendentemente dalla significatività, saranno inserite in modelli di regressione dei rischi proporzionali di Cox multivariata per identificare fattori prognostici indipendenti. L'assunzione dei rischi proporzionali sarà testata. I risultati saranno presentati come rapporti di rischio (HR) con IC al 95%.
• Associazione con Dati Clinicopatologici. Lo stato del biomarcatore e i pattern di discordanza saranno correlati con variabili clinicopatologiche e modalità terapeutiche utilizzando il test del chi-quadrato o il test esatto di Fisher per le variabili categoriche, e il t-test o il test U di Mann-Whitney per le variabili continue, a seconda dei casi. Queste analisi sfrutteranno il set di dati clinicopatologici completo stabilito all'interno della coorte genitore GASTROBRAIN.
• Gestione dei Dati Mancanti. La proporzione di dati mancanti sarà riportata per tutte le variabili. I pattern di mancanza saranno esplorati. Data la natura ancillare di questo studio traslazionale, solo i casi con dati completi appaiati del biomarcatore saranno inclusi in questa analisi.