Entwicklung und Anwendung einer neuartigen digitalen Array-PCR für akute myeloische Leukämie (AML)

Unter minimaler Resterkrankung (MRD) versteht man das Vorhandensein von Krebszellen, die nach der Therapie vorhanden sind und durch klinische Befunde, einschließlich klinischer Standardtests und Röntgenbildgebung, nicht anderweitig nachweisbar sind. Die Erkennung von MRD, bevor sie klinisch nachweisbar wird, bietet die Möglichkeit, einzugreifen und die Behandlung zu optimieren, mit der Möglichkeit, mehr Patienten zu heilen. Aus den oben genannten Gründen stellt die Erkennung von MRD durch die Bewertung blutbasierter Biomarker einen vielversprechenden Bereich zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse bei Patienten mit einer Vielzahl fester und flüssiger Tumoren dar. Bei flüssigen Tumoren wie der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) gehört die MRD-Beurteilung bereits zur klinischen Routine. MRD korreliert stark mit dem Rückfallrisiko bei ALL, und die MRD-Beurteilung während und nach der Induktionstherapie ist einer der aussagekräftigsten verfügbaren Prognosemarker. Aus diesen Gründen weisen die Richtlinien des National Comprehensive Cancer Network (NCCN), Version 2.2020, darauf hin, dass die MRD-Bewertung ein „wesentlicher Bestandteil der Patientenbewertung im Verlauf der sequentiellen Therapie“ für ALL ist, und es gibt >250 Hinweise auf MRD bei Kindern und Erwachsenen ALLE NCCN-Richtlinien. Bei AML wird die MRD-Bewertung routinemäßig in akademischen medizinischen Zentren eingesetzt. MRD ist auch stark mit dem Risiko eines Rückfalls bei AML verbunden, und der MRD-Status ist ein starker unabhängiger Prädiktor für das Gesamtüberleben nach Abschluss der Therapie. Die AML NCCN Guidelines Version 3.2020 weisen auf die „unbestreitbare Notwendigkeit einer Überwachung“ hin, es sind jedoch weitere Verfeinerungen erforderlich, um die MRD-Überwachung bei Patienten mit AML zuverlässiger zu machen. In dieser Studie werden wir eine neue hochmultiplexierte digitale PCR-Technologie, die Digital Array PCR (daPCR), zur Bewertung von MRD bei AML anwenden, die die Zuverlässigkeit von MRD-Assays verbessern und gleichzeitig Kosten und Zeit bis zum Ergebnis reduzieren wird.

Zu den Methoden zur MRD-Beurteilung bei AML gehören derzeit die Durchflusszytometrie zum Nachweis abweichender Immunphänotypen sowie molekulare PCR- und Next-Generation-Sequencing (NGS)-basierte Tests zum Nachweis wiederkehrender AML-assoziierter genetischer Anomalien. Sowohl die Fluss- als auch die molekulare MRD-Beurteilung weisen eine viel höhere Empfindlichkeit auf als die morphologische Beurteilung allein, wobei die Durchflusszytometrie eine untere Nachweisgrenze zwischen 10-4 und 10-5 und molekulare Methoden zwischen 10-3 für NGS-Methoden und 10-5 für PCR-basierte Methoden aufweist Methoden. Jede der aktuellen Methoden weist erhebliche Einschränkungen auf, die eine breitere Einführung bei der Bekämpfung von Geldwäsche verhindern. Standard-NGS-basierte Methoden weisen eine unzureichende Empfindlichkeit und hohe Kosten auf. Die Durchflusszytometrie ist eine technisch schwierige Methode, deren Standardisierung schwierig ist, und eine Untergruppe der AML-Fälle verfügt nicht über genügend auswertbare Oberflächenmarker, um eine Erkennung zu ermöglichen. PCR-basierte Methoden können sehr empfindlich sein, aber jeder Test zielt derzeit auf eine einzelne wiederkehrende genetische Anomalie ab (z. B. PML/RARA-Fusion bei akuter Promyelozytärer Leukämie), und viele AML-Fälle weisen keine genetischen Anomalien auf, auf die aktuelle klinische Tests abzielen. Im Gegensatz dazu bietet die daPCR-Technologie, die wir in dieser Studie anwenden möchten, eine Multiplex-Plattform mit hohem Durchsatz (24–96 Varianten) mit beispiellosem Dynamikbereich (>108), hoher Benutzerfreundlichkeit, niedrigen Kosten und kurzen Durchlaufzeiten. Da die daPCR gleichzeitig nach mehreren Varianten suchen kann, gehen wir davon aus, dass unser erster Test das Potenzial haben wird, die Häufigkeit von mindestens einer AML-assoziierten Mutation in etwa 80 % der AML-Proben nachzuweisen und zu quantifizieren. Dieser technologische Fortschritt würde eine reale Lösung bieten, um eine häufige und umfassende Überwachung des therapeutischen Ansprechens bei Patienten mit AML zu ermöglichen.