Sviluppo e applicazione di una nuova PCR con array digitale per la leucemia mieloide acuta (LMA)

La malattia minima residua (MRD) si riferisce alla presenza di cellule tumorali presenti dopo la terapia e non altrimenti rilevabili dai risultati clinici, compresi i test clinici standard e l'imaging radiografico. Il rilevamento della MRD prima che diventi clinicamente rilevabile offre l’opportunità di intervenire e ottimizzare il trattamento, con la possibilità di curare più pazienti. Per le ragioni sopra esposte, il rilevamento della MRD attraverso la valutazione di biomarcatori ematici rappresenta un’area promettente per migliorare i risultati clinici in pazienti con una varietà di tumori solidi e liquidi. Nei tumori liquidi come la leucemia linfoblastica acuta (LLA), la valutazione della MRD fa già parte della pratica clinica di routine. La MRD è fortemente correlata al rischio di recidiva nella LLA e la valutazione della MRD durante e dopo la terapia di induzione è uno dei marcatori prognostici più informativi disponibili. Per questi motivi, le linee guida del National Comprehensive Cancer Network (NCCN), versione 2.2020, indicano che la valutazione della MRD è una "componente essenziale della valutazione del paziente nel corso della terapia sequenziale" per la LLA e vi sono più di 250 riferimenti alla MRD in ambito pediatrico e adulto. TUTTE le linee guida del NCCN. Nella LMA, la valutazione della MRD viene utilizzata abitualmente nei centri medici accademici. La MRD è anche fortemente associata al rischio di recidiva della leucemia mieloide acuta e lo stato della MRD è un forte predittore indipendente della sopravvivenza globale dopo il completamento della terapia. Le linee guida AML NCCN versione 3.2020 indicano "l'innegabile necessità di monitoraggio", ma sono necessari ulteriori perfezionamenti per rendere più affidabile il monitoraggio della MRD nei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta. In questo studio applicheremo una nuova tecnologia PCR digitale altamente multiplex, Digital Array PCR (daPCR), per la valutazione della MRD nell'AML che migliorerà l'affidabilità del test MRD riducendo al contempo i costi e i tempi per ottenere risultati.

Attualmente, i metodi per la valutazione della MRD nella LMA includono la citometria a flusso per il rilevamento di immunofenotipi aberranti, nonché test basati sulla PCR molecolare e sul sequenziamento di prossima generazione (NGS) per il rilevamento di anomalie genetiche ricorrenti associate alla LMA. Sia la valutazione della MRD a flusso che quella molecolare hanno una sensibilità molto più elevata rispetto alla sola valutazione morfologica, con la citometria a flusso che ha un limite di rilevamento inferiore compreso tra 10-4 e 10-5 e i metodi molecolari tra 10-3 per i metodi NGS e 10-5 per quelli basati su PCR metodi. Ciascuno dei metodi attuali presenta importanti limitazioni che impediscono una più ampia adozione nel campo della lotta antiriciclaggio. I metodi standard basati su NGS hanno una sensibilità insufficiente e costi elevati. La citometria a flusso è un metodo tecnicamente difficile da standardizzare e un sottoinsieme di casi di leucemia mieloide acuta non dispone di marcatori di superficie valutabili sufficienti per consentire il rilevamento. I metodi basati sulla PCR possono essere molto sensibili, ma ciascun test attualmente mira a una singola anomalia genetica ricorrente (ad esempio, la fusione PML/RARA nella leucemia promielocitica acuta) e molti casi di LMA non presentano anomalie genetiche prese di mira dagli attuali test clinici. Al contrario, la tecnologia daPCR che proponiamo di applicare in questo studio fornisce una piattaforma multiplex ad alto rendimento (24-96 varianti) con un intervallo dinamico senza precedenti (> 108), elevata facilità d'uso, basso costo e tempi di consegna rapidi. Poiché la daPCR può rilevare simultaneamente più varianti, stimiamo che il nostro test iniziale avrà il potenziale per rilevare e quantificare l'abbondanza di almeno una mutazione associata alla LMA in circa l'80% dei campioni di LMA. Questo progresso tecnologico fornirebbe una soluzione reale per consentire un monitoraggio frequente e approfondito della risposta terapeutica nei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta.