Personalizzazione del trattamento antiTB: valutazione dei determinanti farmacologici della risposta al trattamento (PAT)

Uno studio longitudinale osservazionale multicentrico sarà condotto in pazienti con diagnosi di tubercolosi polmonare attiva.

Verranno registrate le seguenti variabili:

• variabili demografiche: età, sesso, etnia, SNP per NAT2, SLCO1B1, ABCB1 e VDR;
• variabili cliniche: peso, altezza, test di funzionalità renale, test di funzionalità epatica, livello di vitamina D (25-OH vitamina D), albuminemia, sierologia per HIV, HCV, presenza di comorbilità (es. diabete mellito), test dell'acuità visiva, presenza di sintomi neuropatici;
• variabili microbiologiche: risultati del test di sensibilità al farmaco fenotipico e genotipico, DNA del Mycobacterium tuberculosis dell'espettorato (PCR), microscopia, coltura, tempo di positività (TTP) in coltura liquida, test IGRA (se eseguito), storia di trattamenti precedenti, localizzazione delle lesioni polmonari, presenza di sedi extrapolmonari;
• variabili terapeutiche: inizio/fine del trattamento, interruzioni del trattamento, dose mg/kg, via di somministrazione.

I pazienti riceveranno farmaci antitubercolari standard secondo le linee guida internazionali (RIF 10 mg/kg, INH 5 mg/kg dose massima 300 mg, ETB 15-20 mg/kg, PZA 25 mg/kg dose massima 2000 mg) in condizioni di fasten, una volta al giorno.

Per misurare le concentrazioni plasmatiche verranno raccolti quattro campioni di sangue (provette da 7 ml di eparina di litio) a 0, 2, 4 e 6 ore dopo la somministrazione. Questa analisi verrà eseguita a 7 e 14 giorni dopo l'inizio del trattamento anti-TB.

Per l'analisi farmacogenetica verrà prelevato un campione di sangue (provetta EDTA da 4 ml) al basale.

I campioni di espettorato saranno raccolti al basale, 7 e 14 giorni per la coltura dei micobatteri.

Verranno eseguite visite mediche e prelievi di sangue (per LFT) al basale, 7 e 14 giorni per indagare la neuro e l'epatotossicità.

Farmacocinetica Dopo la raccolta i campioni saranno centrifugati (3000 giri min-1 a 4°C per 10 min) e il plasma sarà congelato a -20°C in 2 aliquote (1 mL di volume) e sarà consegnato al Laboratorio di Farmacocinetica e Farmacogenetica dell'Ospedale Amedeo di Savoia dell'Università di Torino, ASLTO2, Torino, Italia.

Le concentrazioni plasmatiche di tutti e quattro i farmaci saranno misurate mediante cromatografia liquida accoppiata con spettroscopia di massa tandem (che consente un'elevata sensibilità nonostante i piccoli volumi di campione). I dati concentrazione-tempo raccolti saranno valutati mediante un approccio non compartimentale per caratterizzare le proprietà farmacocinetiche allo stato stazionario. L'AUC, i livelli massimo (Cmax) e minimo (Cmin) del farmaco e l'emivita di eliminazione plasmatica saranno utilizzati per valutare le proprietà di induzione enzimatica di questi farmaci. Il DNA di Pharmacogenomics (PG) sarà estratto dal sangue intero utilizzando il QIamp DNA Mini Kit (Quiagen, Valencia, CA). Il DNA purificato ed eluito sarà utilizzato direttamente per la reazione di real-time PCR (BIORAD, Milano, Italia). L'analisi di discriminazione allelica sarà eseguita utilizzando i saggi TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Gli SNP analizzati saranno:

ABCB1 3435C>T (rs1045642), OATP1B1 521T>C (rs4149056) e OATP1B1 85-7793T>C (rs4149032), PXR 63396C>T (rs2472677), BsmI G>A (rs1544410).

e NAT2G>A (rs1799930). Il metodo per la determinazione delle concentrazioni plasmatiche sui DPS sarà sviluppato e convalidato dal nostro laboratorio. Nello studio, i campioni di sangue per la valutazione sui DPS saranno ottenuti solo da soggetti del nostro istituto. Dopo la centrifugazione (3000 giri min-1 a 4°C per 10 min) 100 μl di plasma verranno prelevati su ciascun filtro di vetro (acquistato da Laboratori Biomicron srl, Italia) e utilizzati per l'analisi farmacocinetica (PK). Il plasma rimanente verrà utilizzato come controllo nell'analisi.

Per l'analisi farmacogenetica (PG) verranno prelevati campioni di sangue venoso da tutti i soggetti e il sangue intero (50 μl per punto) verrà individuato su DBS Whatman 903 protein saver card (VWR International, Milano, Italia).

La DBS verrà inserita in un sacchetto di alluminio con essiccante (Foil Bag e Desiccant Packs, acquistati da Laboratori Biomicron srl, Italia) e quindi conservata a temperatura ambiente. Dopo un massimo di 30 giorni i campioni saranno consegnati al Laboratorio di Farmacocinetica e Farmacogenetica dell'Ospedale Amedeo di Savoia dell'Università di Torino, ASLTO2, Torino, Italia. Saranno conservati a -20°C fino all'esecuzione dell'analisi (entro 3 mesi dalla raccolta).

Tempo alla positività Il tempo alla positività sulle colture dell'espettorato al basale, 7 e 14 giorni sarà calcolato utilizzando il software BD Epicenter integrato nel BACTEC MGIT System (Mycobacteria Growth Indication Tube) 960. Il tempo predefinito è 42 giorni.