th2 Modulazione CRSwNP

Scopo:

La CRS è una malattia poco conosciuta, con strategie terapeutiche non ottimali e un elevato carico di malattia. L'immunità adattativa sotto forma di risposte delle cellule T polarizzate Th2 e cambio di classe IgE delle cellule B e infiltrazione di plasmacellule, sono una componente fondamentale della CRS eosinofila e dell'asma, tuttavia la nostra comprensione dell'immunità adattativa nella CRS rimane limitata. La modulazione della risposta Th2, attraverso il blocco dell’IL-5, porta a risultati contrastanti per i pazienti con CRSwNP. Esistono numerosi pazienti che ottengono un migliore controllo dell’asma con terapie che bloccano l’IL-5 ma non riescono a vedere gli stessi miglioramenti nella loro malattia nasale, sottolineando la comprensione attualmente limitata dei fattori coinvolti nell’attività della malattia, degli endotipi della malattia e degli effetti della modulazione dell’asma. Risposta Th2 in questo ambiente tissutale. Una migliore comprensione della modulazione dell’immunità del tessuto nasale mediante il blocco dell’IL-5 a livello cellulare è un passo essenziale verso un’adeguata selezione dei pazienti e lo sviluppo di nuove terapie mirate. La trascrittomica unicellulare è un potente strumento per caratterizzare i paesaggi immunitari dei tessuti e le variazioni funzionali, ma è stata ancora scarsamente utilizzata al di là degli studi sull'epitelio nasale nella CRS

Ipotesi

• Il blocco dell'IL-5 stimola l'aumento dell'attività delle cellule T del tessuto nasale > delle cellule T del sangue periferico e promuove l'aumento della polarizzazione Th2 delle cellule T dei tessuti
• Il blocco di IL-5 stimola l'aumento dell'attività del centro germinale delle cellule B nelle strutture linfoidi nasali secondarie e terziarie, attraverso maggiori interazioni tra cellule Tfh-B e una maggiore maturazione delle cellule che secernono anticorpi tissutali attraverso la sovraregolazione di BLIMP1 nelle cellule B del centro germinale.

Obiettivi

1. Caratterizzare la risposta locale delle cellule B della mucosa negli organi linfoidi terziari (nasale) e secondari (spazio postnasale) in CRSwNP, rispetto all'immunità circolante, attraverso la visualizzazione e la modellazione dell'attività del centro germinale, il supporto cellulare per l'attività del centro germinale e la valutazione della selezione clonale delle cellule B , cambio di classe, destino e ipermutazione somatica mediante trascrittomica unicellulare, sequenziamento BCR (recettore delle cellule B) unicellulare e risoluzione spaziale attraverso la microscopia confocale.
2. Utilizzare la trascrittomica unicellulare e l'analisi del repertorio VDJ (variabile, diversità e unione) per caratterizzare gli effetti della modulazione Th2, attraverso il blocco di IL-5, sulla formazione e il mantenimento della memoria immunitaria adattativa delle cellule T e B nasali.
3. Localizzare le fonti nasali di segnalazione proinfiammatoria in CRSwNP in presenza di blocco di IL-5, utilizzando la trascrittomica di singole cellule, la microscopia confocale e l'analisi delle citochine nasali.
4. Confrontare sottoinsiemi di cellule pro-infiammatorie nasali con campioni di sangue periferico accoppiati mediante trascrittomica di singole cellule, per correlare l'attività con i candidati biomarcatori.

Progetto di ricerca

Lo studio proposto è uno studio prospettico di medicina sperimentale che utilizza il blocco dell'IL-5 come modo per studiare gli effetti della modulazione Th2 sulla generazione dell'immunità adattativa tissutale locale nella CRSwNP. I partecipanti verranno classificati in:

• Gruppo di trattamento: 20 soggetti con CRSwNP e asma che inizieranno il trattamento con mepolizumab
• Gruppo di controllo della malattia: 10 soggetti con CRSsNP senza asma che non inizieranno Mepolizumab e continueranno il trattamento standard di cura.
• Gruppo di controllo: 10 soggetti sani senza alcuna malattia dei seni

Questo studio prevede tre visite di studio per il braccio di trattamento (basale, settimane 6 e 30), due visite per i soggetti di controllo della malattia e una visita (basale) per i soggetti sani di controllo.

I partecipanti al trattamento con il farmaco in studio riceveranno 100 mg di mepolizumab ogni 4 settimane per via sottocutanea.

Braccio di trattamento:

CRSwNP (NPS 1-8) e asma sottoposto a blocco di IL-5 (Mepolizumab)

• Settimana 0: reclutamento, screening e avvio della terapia standard

o Campioni nasali e di sangue Settimana 6 - Prima dell'inizio del trattamento con mepolizumab (Pre-trattamento) Settimana 30 - Dopo l'inizio del trattamento con Mepolizumab (durante il trattamento)

Braccio di controllo:

1. Controllo delle malattie:

   CRSsNP senza asma

   • Settimana 0: reclutamento, screening e avvio della terapia standard

   o Campioni nasali e di sangue Settimana 6 - Dopo 6 settimane di terapia standard

2. Controllo sano • Settimana 0: reclutamento e screening, campioni nasali e di sangue

Analisi statistica Dati di sequenziamento dell'RNA di singole cellule I dati sequenziati saranno allineati con CellRanger v7.0. I file di output risultanti verranno elaborati utilizzando un filtro standard e una pipeline di controllo qualità in Scanpy. La correzione batch verrà eseguita utilizzando scVI e verrà eseguito il clustering Leiden. Le etichette dei cluster verranno assegnate utilizzando geni marcatori canonici e firme genetiche pubblicate, con convalida utilizzando un set di dati pubblicato di cellule immunitarie ordinate tramite il pacchetto SingleR. L'analisi a valle includerà, ma non sarà limitata a, l'analisi dell'espressione del set di geni (GSEA) dei set di gene Hallmark e Gene Ontology, test di abbondanza differenziale, analisi della rete di coespressione genica ponderata e imputazione dell'interazione cellula-cellula utilizzando CellphoneDB. L'analisi TCR verrà eseguita utilizzando Scirpy e l'analisi BCR con le suite Dandelion e Immcantation