Effetto della rapamicina sui biomarcatori correlati alla tolleranza sui destinatari stabili del trapianto di fegato

Obiettivo: testare nei riceventi di trapianto di fegato identificati come non tolleranti se l'interruzione degli inibitori della calcineurina seguita da un trattamento di 6 mesi con sirolimus modifica il pattern di espressione dell'insieme di geni associati alla tolleranza

Sfondo: Sirolimus è un farmaco immunosoppressore utilizzato per contrastare l'autoimmunità e prevenire il rigetto acuto del trapianto nell'uomo e ha notevoli proprietà di promozione della tolleranza nei modelli di trapianto animale.

Ipotesi/obiettivi specifici: ipotizziamo che il sirolimus promuova le vie tollerogeniche nel trapianto di fegato umano.

1. Testare nei riceventi di trapianto di fegato identificati come non tolleranti se l'interruzione degli inibitori della calcineurina seguita da un trattamento di 6 mesi con sirolimus modifica il pattern di espressione dell'insieme di geni associati alla tolleranza
2. Testare nei riceventi di trapianto di fegato identificati come non tolleranti se la conversione dagli inibitori della calcineurina al sirolimus modifica le risposte immunitarie di tipo memoria.
3. Testare nei riceventi di trapianto di fegato identificati come non tolleranti se la conversione dalla monoterapia con inibitore della calcineurina a sirolimus influenzi la frequenza, il fenotipo e la funzione dei sottogruppi di linfociti del sangue periferico potenzialmente immunoregolatori
4. Testare nei riceventi di trapianto di fegato identificati come non tolleranti se la conversione dagli inibitori della calcineurina al sirolimus promuova i cambiamenti epigenetici correlati all'immunoregolazione e allo sviluppo/progressione del cancro

Metodi proposti:Esperimenti di espressione genica: quantificheremo l'espressione nel sangue periferico di un insieme di geni precedentemente identificati come predittivi del successo dell'interruzione dell'immunosoppressione in riceventi stabili di trapianto di fegato. I campioni di sangue saranno ottenuti prima e 6 mesi dopo la conversione al trattamento con sirolimus. La misurazione dei livelli di espressione genica sarà condotta impiegando la PCR TaqMan in tempo reale. La classificazione dei pazienti nelle categorie tolleranti/non tolleranti sarà condotta utilizzando soglie e algoritmi predittivi sviluppati nel nostro laboratorio.

Studi di immunofenotipizzazione: quantificheremo nel sangue periferico vari sottoinsiemi di cellule mononucleate implicati nelle vie immunoregolatorie prima e 6 mesi dopo la conversione al trattamento con sirolimus. Le misurazioni saranno condotte utilizzando la citometria a flusso.

Saggi funzionali: isoleremo le cellule T regolatorie CD4+CD25+ (Treg) dal sangue periferico mediante Sorter prima e 6 mesi dopo la conversione al trattamento con sirolimus. Saranno condotti esperimenti di diluizione seriale in un saggio non specifico dell'antigene per valutare le relative proprietà soppressive delle Treg. I saggi IFNg ELISpot saranno condotti in parallelo impiegando cellule mononucleate del sangue periferico come cellule responder per misurare le risposte alloimmuni specifiche del donatore.

Misurazione della metilazione del DNA: il DNA ricevente verrà estratto da campioni di sangue periferico prima e dopo il trattamento con sirolimus di 6 mesi e utilizzato per condurre studi di metilazione dell'intero genoma utilizzando la piattaforma dell'array ILLUMINA.

Risultati attesi: Ci aspettiamo di definire con precisione gli effetti del sirolimus sui percorsi tolerogenici precedentemente identificati nell'uomo e di valutare la capacità di questo farmaco di aumentare la proporzione di riceventi epatici sottoposti a svezzamento immunosoppressivo di successo.