Uno Studio Nazionale Svedese che Valuta il Dd-cfDNA come Biomarcatore Diagnostico per il Monitoraggio del Rigetto nel Trapianto di Cuore (SweD-HTx)

Introduzione:

Il trapianto cardiaco (HTx) e la terapia con dispositivo di assistenza ventricolare sinistra (LVAD) sono le principali opzioni di trattamento per l'insufficienza cardiaca avanzata. Sebbene l'HTx migliori la sopravvivenza, presenta rischi sia a breve che a lungo termine, tra cui lesioni immuno-mediate ed effetti avversi degli immunosoppressori. Il rigetto dell'alloinnesto cardiaco colpisce il 15-20% dei riceventi e spesso richiede un aumento dell'immunosoppressione. La diagnosi precoce è fondamentale e le biopsie endomiocardiche seriali (EMB) rimangono il metodo di sorveglianza standard.

Recentemente, sono emersi biomarcatori come il DNA libero da cellule di origine donatrice (dd-cfDNA) per rilevare infiammazione e danno cellulare. Il dd-cfDNA riflette l'apoptosi e la necrosi nell'organo trapiantato e può essere misurato come frazione del DNA libero da cellule totale tramite saggi basati su PCR. È un marcatore sensibile del rigetto precoce mediato da anticorpi (AMR) e del rigetto cellulare acuto (ACR), spesso aumentando prima che si osservino cambiamenti istopatologici. Negli Stati Uniti, i saggi dd-cfDNA sono comuni post-trapianto, ma in Europa il loro utilizzo è limitato da costi e accessibilità.

In Svezia, vengono eseguiti 60-70 trapianti cardiaci ogni anno, con protocolli nazionali che guidano le cure post-trapianto. Nel primo anno vengono eseguite EMB frequenti. C'è bisogno di monitoraggio non invasivo per ridurre il disagio del paziente e migliorare la diagnostica. Questo studio mira a stabilire un protocollo nazionale di test dd-cfDNA utilizzando il sequenziamento di nuova generazione e ad avanzare la comprensione del rigetto e dell'attivazione immunitaria.

Materiali e Metodi:

Disegno dello Studio:

Lo studio SweD-HTx è una coorte osservazionale multicentrica che coinvolge riceventi adulti di HTx dello Skåne University Hospital (Lund), del Sahlgrenska University Hospital (Gothenburg) e del Karolinska University Hospital (Stoccolma). I trapianti vengono eseguiti a Skåne o Sahlgrenska, con follow-up in tutti e tre i siti. I pazienti eleggibili sono adulti (≥18 anni) sottoposti a HTx ortotopico. Criteri di esclusione: gravidanza, trapianto multi-organo o precedente trapianto di organo solido/cellule staminali ematopoietiche.

I campioni di sangue vengono raccolti secondo protocolli standard e inviati a laboratori di immunologia. Alcuni campioni sono crioconservati. I dati clinici e demografici vengono raccolti da registri elettronici.

Popolazione dello Studio:

I pazienti vengono reclutati dopo essere stati accettati per HTx, con l'obiettivo di arruolare 120 partecipanti a livello nazionale, con reclutamento previsto entro 2 anni (primo paziente: febbraio 2025). È richiesto il consenso informato scritto.

Visite di Studio e Raccolta Campioni:

Il sangue per dd-cfDNA e DSA viene raccolto prospetticamente a intervalli prestabiliti, coordinato con EMB di routine: settimane 1-4, mesi 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 8-9, 10-12, 16, 20 e 24 post-trapianto, variando per protocollo del centro. I campioni vengono processati e il plasma conservato a -80 °C. L'analisi DSA viene eseguita ad ogni visita. I pazienti vengono monitorati per cinque anni con raccolta dati annuale.

L'esito primario è la correlazione tra livelli di dd-cfDNA e rigetto provato da biopsia (secondo criteri ISHLT). I cambiamenti longitudinali in dd-cfDNA e DSA, così come la loro associazione, saranno analizzati.

Sottostudi Pianificati:

1. Incidenza di disfunzione dell'innesto (GDF) e CAV in cinque anni, esaminata in relazione a DSA e dd-cfDNA.
2. Associazione tra dd-cfDNA e biomarcatori circolanti di danno o infiammazione dell'innesto.

Analisi dd-cfDNA: La quantificazione del dd-cfDNA viene effettuata con un saggio di sequenziamento di nuova generazione (NGS). La frazione dd-cfDNA (%) è calcolata come: (cfDNA di origine donatrice / cfDNA totale) × 100. Tutte le analisi seguono protocolli validati e istruzioni del produttore.

Valutazione Istopatologica:

Le EMB vengono classificate localmente da patologi cardiovascolari secondo linee guida ISHLT (2005 per ACR, 2013 per AMR). Il rigetto è definito come pAMR1(H+), pAMR1(I+), pAMR2, pAMR3, ACR grado 2R o 3R, o loro combinazioni. Non rigetto: pAMR0, ACR gradi 0 o 1R. I risultati sono documentati in registri elettronici.

Analisi degli Anticorpi Specifici del Donatore:

I DSA vengono analizzati in ogni centro utilizzando la piattaforma Luminex xMAP, riportati come intensità media di fluorescenza (MFI). Saranno esplorate le relazioni tra DSA, dd-cfDNA e risultati delle biopsie.

Considerazioni Etiche:

Lo studio ha approvazione etica (Riferimento: 2024-03357-01, 2025-04085-02) e segue la Dichiarazione di Helsinki, le linee guida etiche ISHLT, la Buona Pratica Clinica e le normative pertinenti. Il consenso informato scritto è ottenuto da tutti i partecipanti.

Gestione Dati e Analisi Statistica:

I dati sono archiviati in un database sicuro, protetto da password, con identificatori codificati. Le statistiche descrittive riassumono le caratteristiche basali. Le associazioni tra dd-cfDNA, DSA e biopsie saranno analizzate con test non parametrici e modelli di regressione multivariata. Le analisi vengono eseguite utilizzando R.

Governance della Sperimentazione:

Lo SweD-HTx è uno studio avviato da investigatori. DEVYSER fornisce i kit di test del DNA, con test eseguiti nei laboratori di immunologia locali utilizzando NGS e controlli standardizzati. Gli investigatori e un comitato direttivo indipendente supervisionano la sperimentazione. DEVYSER non ha alcun ruolo nella raccolta, analisi, interpretazione dei dati o decisioni di pubblicazione. Lo studio ha ricevuto finanziamenti dalla Regione Stoccolma (borse ALF).

Risultati:

Al 1 gennaio 2026, 72 partecipanti sono stati arruolati da tutti i centri, con 436 campioni raccolti. I dati includono demografia, risultati di laboratorio e regimi immunosoppressivi ad ogni punto temporale di campionamento. I livelli di DSA e dd-cfDNA saranno correlati e analizzati longitudinalmente, con sottostudi pianificati su imaging e follow-up a lungo termine.