DNA circulante em NSCLC tratado cirurgicamente

A biópsia líquida de plasma está surgindo rapidamente como uma ferramenta de diagnóstico não invasiva que pode ser usada como um substituto para a biópsia de tumor ou atividade da doença. O DNA livre de células circulantes (cfDNA) é um fragmento curto de DNA de cadeia dupla que está presente no sangue. Técnicas específicas de mutação ultrassensíveis baseadas na análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) são necessárias para detectar mutações e alterações nas células tumorais circulantes. Estudos iniciais baseados em um pequeno número de pacientes indicam que as análises de ctDNA podem ser usadas para testes moleculares, detecção de câncer, substituto para carga ou atividade tumoral e monitoramento de tratamento em tumores sólidos.

No presente estudo, será investigado o papel do ctDNA do plasma em pacientes com NSCLC em estágio inicial tratados cirurgicamente. Os investigadores pretendem coletar uma coorte prospectiva de cem pacientes com amostras pré-operatórias e de acompanhamento, bem como amostras de tecido para diagnóstico. Os investigadores levantam a hipótese de que amostras longitudinais de ctDNA podem ser usadas como marcador prognóstico para recorrência e sobrevida. Encontrar ctDNA pós-cirúrgico positivo pode nos ajudar a identificar pacientes que se beneficiariam da quimioterapia adjuvante antes da recorrência clínica.

Desenho do estudo e considerações éticas

Este é um estudo prospectivo, não intervencional, de braço único, que será conduzido em colaboração com o Helsinki Biobank. Estima-se que uma coorte de 100 pacientes fornecerá um tamanho de amostra amplo, pois 30-40% desenvolverão uma recorrência durante os 5 anos de acompanhamento. Foi feito um acordo preliminar com o Helsinki Biobank sobre a coleta e armazenamento de amostras. Não haverá consultas de estudo adicionais, pois todas as visitas de controle e amostras de estudo são agendadas de acordo com o protocolo clínico normal. Os pacientes serão recrutados de 1.5.2019 a 31.12.2020. Os pacientes recrutados fornecerão um consentimento informado por escrito para este estudo e um consentimento do Helsinki Biobank que abrange plasma e amostras cirúrgicas. Os participantes podem retirar o consentimento a qualquer momento do estudo. As amostras do Biobanco serão coletadas simultaneamente com as amostras clínicas, minimizando o dano adicional aos participantes. Uma permissão do conselho de revisão da instituição do Helsinki University Hospital (HUS) (HUS 60/2019) e uma declaração ética foram concedidas (455/2019). O estudo será conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque.

Pacientes

Os pacientes são recrutados antes da cirurgia na reunião pré-operatória da equipe multidisciplinar (MDT). O critério de inclusão neste estudo é NSCLC confirmado histologicamente, elegível para tratamento cirúrgico e virgem para tratamentos oncológicos sistêmicos com tecido embebido em parafina fixado em formalina ou amostra de tecido fresco congelada disponível.

Os dados clínicos do paciente serão coletados de registros médicos eletrônicos (EMR) em cada ponto do tempo (por exemplo, pré-operatório, operatório, acompanhamento). Cada paciente é avaliado em reuniões de MDT antes e depois da cirurgia, onde é determinado o estágio clínico e patológico. Além disso, a relação consolidação radiológica/tumor será calculada a partir de tomografias computadorizadas (TC) pré-operatórias. Esses dados serão transferidos para um banco de dados eletrônico seguro e certificado (Granitics Unify Med) com acesso apenas pelos pesquisadores do grupo.

Coleta de amostras de sangue e tecidos

As amostras de sangue e tecido serão coletadas simultaneamente com as amostras clínicas. Os investigadores pretendem coletar amostras de tecido removidas cirurgicamente, bem como amostras pré-operatórias e de acompanhamento de cfDNA de todos os pacientes. Além de amostras cirúrgicas, amostras de tecido serão coletadas de lesões metastáticas, incluindo amostras de autópsia em pacientes falecidos. Se ainda não tiver sido coletada, a amostra de sangue padrão do Biobank será coletada simultaneamente às amostras pré-operatórias.

As amostras de plasma serão coletadas no momento das amostras clínicas de sangue do paciente. Uma amostra pré-operatória será coletada 1-2 dias antes da cirurgia. A primeira amostra de acompanhamento pós-operatório será coletada na visita cirúrgica 4-6 semanas após a operação. A segunda e a terceira amostras de acompanhamento serão coletadas aos 6 e 12 meses durante a visita de acompanhamento clínico. Em cada ponto de tempo, as amostras de cfDNA serão coletadas em tubos de coleta especializados duplicados contendo fixadores para estabilizar o DNA da fragmentação (2 x 10ml Streck cfDNA BCT). A amostra de sangue será centrifugada para extrair o plasma. As amostras de plasma e tecido serão armazenadas a -80 graus Celsius no Helsinki Biobank.

Resultados do estudo As mutações pré-operatórias do ctDNA serão combinadas com parâmetros clinicamente importantes, como sobrevida livre de doença, tamanho do tumor, histologia, estágio TNM e sobrevida geral. A recorrência clínica do câncer será obtida a partir de amostras radiológicas ou de tecido tumoral. A sobrevida livre de doença será avaliada desde a cirurgia até a recorrência da doença em reuniões de MDT ou morte. A sobrevida global é avaliada desde a cirurgia até a morte como resultado de qualquer causa.

análise genética

A análise quantitativa e específica de mutação do ctDNA será feita via painel de genoma de exoma tumoral/somático que inclui painel de 23.000 genes com 50 milhões de bases. O isolamento do DNA germinativo será feito a partir da camada leucocitária retirada da amostra de sangue dos pacientes (B-Bio-0). Em primeiro lugar, para alcançar verdadeiras mutações somáticas, a variação da linhagem germinativa é deletada do ctDNA. Em segundo lugar, o ctDNA será comparado com as mutações do DNA do tecido tumoral para excluir achados falsos positivos. Em terceiro lugar, mutações semelhantes ou novas coletadas de amostras de acompanhamento serão usadas para detectar doença residual pós-cirúrgica ou recorrência do câncer.

O sequenciamento será feito em colaboração com o Institute for Molecular Medicine Finland (FIMM), com seu painel genético proprietário.