Krążące DNA w chirurgicznie leczonym NSCLC

Płynna biopsja osocza jest szybko pojawiającym się nieinwazyjnym narzędziem diagnostycznym, które może być stosowane jako substytut biopsji guza lub aktywności choroby. Krążący wolny od komórek DNA (cfDNA) to krótki fragment dwuniciowego DNA, który jest obecny we krwi. Do wykrywania mutacji i zmian w krążących komórkach nowotworowych wymagane są ultraczułe techniki specyficzne dla mutacji, oparte na analizie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Wczesne badania oparte na niewielkiej liczbie pacjentów wskazują, że analizy ctDNA mogą być wykorzystywane do badań molekularnych, wykrywania raka, surogatu obciążenia lub aktywności nowotworu oraz monitorowania leczenia guzów litych.

W obecnym badaniu zostanie zbadana rola ctDNA z osocza u leczonych chirurgicznie pacjentów z wczesnym stadium NSCLC. Badacze mają na celu zebranie prospektywnej kohorty stu pacjentów z próbkami przedoperacyjnymi i kontrolnymi, a także diagnostycznymi próbkami tkanek. Badacze stawiają hipotezę, że podłużne próbki ctDNA można wykorzystać jako marker prognostyczny nawrotu i przeżycia. Znalezienie pooperacyjnego dodatniego ctDNA może pomóc nam zidentyfikować pacjentów, którzy odnieśliby korzyść z chemioterapii adjuwantowej przed nawrotem klinicznym.

Projekt badania i względy etyczne

Jest to prospektywne, nieinterwencyjne, jednoramienne badanie, które zostanie przeprowadzone we współpracy z Helsinki Biobank. Szacuje się, że kohorta 100 pacjentów zapewni wystarczającą wielkość próby, ponieważ u 30-40% rozwinie się nawrót w ciągu 5 lat obserwacji. Zawarto wstępne porozumienie z Helsinki Biobank w sprawie pobierania i przechowywania próbek. Nie będzie dodatkowych terminów badań, ponieważ wszystkie wizyty kontrolne i próbki do badań są zaplanowane zgodnie z normalnym protokołem klinicznym. Pacjenci będą rekrutowani od 1.5.2019 do 31.12.2020. Zrekrutowani pacjenci przedstawią zarówno pisemną świadomą zgodę na to badanie, jak i zgodę Helsinki Biobank, która obejmuje próbki osocza i próbki chirurgiczne. Uczestnicy mogą wycofać zgodę w dowolnym momencie badania. Próbki Biobanku będą pobierane jednocześnie z próbkami klinicznymi, co minimalizuje dodatkowe szkody dla uczestników. Uzyskano zezwolenie komisji rewizyjnej szpitala uniwersyteckiego w Helsinkach (HUS) (HUS 60/2019) i oświadczenie etyczne (455/2019). Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.

Pacjenci

Pacjenci są rekrutowani przed operacją z przedoperacyjnego spotkania zespołu multidyscyplinarnego (MDT). Kryteriami włączenia do tego badania jest potwierdzony histologicznie NSCLC kwalifikujący się do leczenia chirurgicznego i niepodlegający systemowemu leczeniu onkologicznemu z dostępną próbką tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie lub świeżo zamrożonej próbki tkanki.

Kliniczne dane pacjenta będą zbierane z elektronicznej dokumentacji medycznej (EMR) w każdym momencie (np. przedoperacyjny, operacyjny, kontrolny). Każdy pacjent jest oceniany na spotkaniach MDT przed i po operacji, na których określany jest stopień zaawansowania klinicznego i patologicznego. Ponadto współczynnik konsolidacji radiologicznej/guza zostanie obliczony na podstawie przedoperacyjnych skanów tomografii komputerowej (CT). Dane te zostaną przesłane do bezpiecznej, certyfikowanej elektronicznej bazy danych (Granitics Unify Med), do której dostęp mają tylko badacze z grupy.

Pobieranie próbek krwi i tkanek

Próbki krwi i tkanek będą pobierane jednocześnie z próbkami klinicznymi. Celem badaczy jest zebranie próbek tkanek usuniętych chirurgicznie, a także przedoperacyjnych i kontrolnych próbek cfDNA od wszystkich pacjentów. Oprócz próbek chirurgicznych zostaną pobrane próbki tkanek ze zmian przerzutowych, w tym próbki z sekcji zwłok zmarłych pacjentów. Jeśli nie została jeszcze pobrana, standardowa próbka krwi z Biobanku zostanie pobrana jednocześnie z próbkami przedoperacyjnymi.

Próbki osocza będą pobierane w czasie klinicznych próbek krwi pacjenta. Próbka przedoperacyjna zostanie pobrana 1-2 dni przed operacją. Pierwsza kontrolna próbka pooperacyjna zostanie pobrana na wizycie chirurgicznej 4-6 tygodni po operacji. Druga i trzecia próbka kontrolna zostanie pobrana po 6 i 12 miesiącach podczas klinicznej wizyty kontrolnej. W każdym punkcie czasowym próbki cfDNA będą zbierane do podwójnych specjalistycznych probówek do pobierania zawierających utrwalacze w celu ustabilizowania DNA przed fragmentacją (2 x 10 ml Streck cfDNA BCT). Próbka krwi zostanie odwirowana w celu ekstrakcji osocza. Próbki osocza i tkanek będą przechowywane w Biobanku w Helsinkach w temperaturze -80 stopni Celsjusza.

Wyniki badań Przedoperacyjne mutacje ctDNA zostaną dopasowane do klinicznie ważnych punktów końcowych, takich jak przeżycie wolne od choroby, wielkość guza, histologia, stadium TNM i całkowite przeżycie. Kliniczna wznowa raka zostanie uzyskana z próbek radiologicznych lub tkanek guza. Przeżycie wolne od choroby będzie oceniane od operacji do nawrotu choroby na spotkaniach MDT lub śmierci. Całkowite przeżycie ocenia się od operacji do śmierci z dowolnej przyczyny.

Analiza genetyczna

Ilościowa i specyficzna dla mutacji analiza ctDNA zostanie przeprowadzona za pomocą panelu genomu nowotworu/egzomu somatycznego, który obejmuje panel 23 000 genów z 50 milionami zasad. Izolacja DNA linii zarodkowej zostanie przeprowadzona z kożuszka leukocytarnego pobranego z próbki krwi pacjenta (B-Bio-0). Po pierwsze, aby osiągnąć prawdziwe mutacje somatyczne, z ctDNA usuwa się zmienność linii zarodkowej. Po drugie, ctDNA zostanie porównane z mutacjami DNA tkanki nowotworowej, aby wykluczyć wyniki fałszywie dodatnie. Po trzecie, podobne lub nowe mutacje zebrane z próbek kontrolnych zostaną wykorzystane do wykrycia pooperacyjnej choroby resztkowej lub nawrotu raka.

Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone we współpracy z Fińskim Instytutem Medycyny Molekularnej (FIMM) z ich zastrzeżonymi panelami genów.