Cirkulující DNA u chirurgicky léčeného NSCLC

Plazmatická tekutá biopsie je rychle se objevující neinvazivní diagnostický nástroj, který by mohl být použit jako náhrada za biopsii nádoru nebo aktivitu onemocnění. Cirkulující bezbuněčná DNA (cfDNA) je krátký fragment dvouvláknové DNA, která je přítomna v krvi. K detekci mutací a změn v cirkulujících nádorových buňkách jsou nutné techniky specifické pro ultrasenzitivní mutace založené na analýze polymerázové řetězové reakce (PCR). Dřívější studie založené na malém počtu pacientů naznačují, že analýzy ctDNA by mohly být použity pro molekulární testování, detekci rakoviny, náhradu za nádorovou zátěž nebo aktivitu a monitorování léčby u solidních nádorů.

V současné studii bude zkoumána úloha ctDNA z plazmy u chirurgicky léčených pacientů s časným stadiem NSCLC. Cílem vyšetřovatelů je shromáždit prospektivní kohortu stovky pacientů s předoperačními a následnými vzorky a také s diagnostickými vzorky tkáně. Výzkumníci předpokládají, že longitudinální vzorky ctDNA by mohly být použity jako prognostický marker pro recidivu a přežití. Nalezení pooperační pozitivní ctDNA by nám mohlo pomoci identifikovat pacienty, kteří by měli prospěch z adjuvantní chemoterapie před klinickou recidivou.

Návrh studie a etické úvahy

Toto je prospektivní, neintervenční, jednoramenná studie, která bude provedena ve spolupráci s Helsinki Biobank. Odhaduje se, že kohorta 100 pacientů poskytne dostatečně velký vzorek, protože u 30–40 % dojde během 5letého sledování k recidivě. Byla uzavřena předběžná dohoda s Helsinki Biobank o odběru a skladování vzorků. Nebudou se konat žádné další schůzky do studie, protože všechny kontrolní návštěvy a studijní vzorky jsou naplánovány podle normálního klinického protokolu. Nábor pacientů bude probíhat od 1.5.2019 do 31.12.2020. Rekrutovaní pacienti poskytnou jak písemný informovaný souhlas s touto studií, tak souhlas Helsinské Biobanky, který zahrnuje vzorky plazmy a chirurgické vzorky. Účastníci mohou svůj souhlas kdykoli odvolat. Vzorky Biobanky budou odebrány současně s klinickými vzorky, čímž se minimalizuje další poškození účastníků. Bylo uděleno povolení kontrolní rady instituce Helsinské univerzitní nemocnice (HUS) (HUS 60/2019) a etické prohlášení (455/2019). Studie bude provedena v souladu s Helsinskou deklarací.

Pacienti

Pacienti jsou vybíráni před operací z předoperačního setkání multidisciplinárního týmu (MDT). Kritériem pro zařazení do této studie je histologicky potvrzený NSCLC způsobilý pro chirurgickou léčbu a naivní pro systémovou onkologickou léčbu buď s tkání zalitou ve formalínu fixovanou v parafínu nebo s čerstvě zmrazeným vzorkem tkáně.

Klinická data pacientů budou shromažďována z elektronických lékařských záznamů (EMR) v každém okamžiku (např. předoperační, operační, kontrolní). Každý pacient je hodnocen na MDT schůzkách před a po operaci, kde je stanoveno jak klinické, tak patologické stadium. Kromě toho bude z předoperačních skenů počítačové tomografie (CT) vypočítán poměr radiologická konsolidace/nádor. Tato data budou přenesena do zabezpečené, certifikované elektronické databáze (Granitics Unify Med) s přístupem pouze skupinovým výzkumníkům.

Odběr vzorků krve a tkáně

Vzorky krve a tkáně budou odebrány současně s klinickými vzorky. Cílem vyšetřovatelů je shromáždit chirurgicky odebrané vzorky tkáně, stejně jako předoperační a následné vzorky cfDNA od všech pacientů. Kromě chirurgických vzorků budou odebrány vzorky tkáně z metastatických lézí včetně pitevních vzorků u zemřelých pacientů. Pokud již nebyl odebrán, standardní vzorek krve Biobanky bude odebrán současně s předoperačními vzorky.

Vzorky plazmy budou odebrány v době klinických vzorků krve pacienta. Předoperační odběr bude odebrán 1-2 dny před operací. První pooperační kontrolní vzorek bude odebrán při chirurgické návštěvě 4-6 týdnů po operaci. Druhý a třetí kontrolní vzorek bude odebrán v 6. a 12. měsíci během návštěvy klinického sledování. V každém časovém bodě budou vzorky cfDNA odebrány do duplikátů specializovaných odběrových zkumavek obsahujících fixativa pro stabilizaci DNA před fragmentací (2 x 10 ml Streck cfDNA BCT). Vzorek krve bude centrifugován, aby se extrahovala plazma. Vzorky plazmy a tkáně budou skladovány při teplotě -80 Celsia v Helsinki Biobank.

Výsledky studie Předoperační mutace ctDNA budou porovnány s klinicky důležitými cílovými parametry, jako je přežití bez onemocnění, velikost nádoru, histologie, stadium TNM a celkové přežití. Klinická recidiva rakoviny bude získána z radiologických vzorků nebo vzorků nádorové tkáně. Přežití bez onemocnění bude hodnoceno od operace po recidivu onemocnění na setkáních MDT nebo úmrtí. Celkové přežití se posuzuje od operace po smrt v důsledku jakékoli příčiny.

Genetická analýza

Kvantitativní a mutačně specifická analýza ctDNA bude provedena pomocí genomového panelu tumoru/somatického exomu, který zahrnuje 23 000 genových panelů s 50 miliony bází. Izolace zárodečné DNA bude provedena z buffy coat odebraného ze vzorku krve pacientů (B-Bio-0). Za prvé, k dosažení skutečných somatických mutací je zárodečná variace odstraněna z ctDNA. Za druhé, ctDNA bude porovnána s mutacemi DNA nádorové tkáně, aby se vyloučily falešně pozitivní nálezy. Za třetí, podobné nebo nové mutace odebrané z kontrolních vzorků budou použity k detekci pooperační reziduální choroby nebo recidivy rakoviny.

Sekvenování bude provedeno ve spolupráci s Institutem pro molekulární medicínu Finland (FIMM) s jejich patentovaným panelem genů.