Zirkulierende DNA bei chirurgisch behandeltem NSCLC

Die Plasma-Flüssigbiopsie entwickelt sich schnell zu einem nicht-invasiven diagnostischen Werkzeug, das als Ersatz für eine Tumorbiopsie oder Krankheitsaktivität verwendet werden könnte. Zirkulierende zellfreie DNA (cfDNA) ist ein kurzes Fragment doppelsträngiger DNA, die im Blut vorhanden ist. Um Mutationen und Veränderungen in zirkulierenden Tumorzellen nachzuweisen, sind hochempfindliche mutationsspezifische Techniken auf der Grundlage der Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (PCR) erforderlich. Frühe Studien, die auf einer kleinen Anzahl von Patienten basieren, weisen darauf hin, dass ctDNA-Analysen für molekulare Tests, Krebserkennung, Surrogat für Tumorlast oder -aktivität und Behandlungsüberwachung bei soliden Tumoren verwendet werden könnten.

In der aktuellen Studie wird die Rolle von ctDNA aus Plasma bei chirurgisch behandelten NSCLC-Patienten im Frühstadium untersucht. Die Forscher zielen darauf ab, eine prospektive Kohorte von hundert Patienten mit präoperativen und Follow-up-Proben sowie diagnostischen Gewebeproben zu sammeln. Die Forscher gehen davon aus, dass Längsschnitt-ctDNA-Proben als prognostischer Marker für Rezidive und Überleben verwendet werden könnten. Das Auffinden postoperativer positiver ctDNA könnte uns helfen, Patienten zu identifizieren, die vor einem klinischen Rezidiv von einer adjuvanten Chemotherapie profitieren würden.

Studiendesign und ethische Überlegungen

Dies ist eine prospektive, nicht-interventionelle, einarmige Studie, die in Zusammenarbeit mit der Helsinki Biobank durchgeführt wird. Es wird geschätzt, dass eine Kohorte von 100 Patienten eine ausreichende Stichprobengröße bieten wird, da 30-40 % während der 5-jährigen Nachbeobachtung ein Rezidiv entwickeln werden. Mit der Helsinki Biobank wurde eine vorläufige Vereinbarung über die Probensammlung und -aufbewahrung getroffen. Es wird keine zusätzlichen Studientermine geben, da alle Kontrollbesuche und Studienproben gemäß dem normalen klinischen Protokoll geplant werden. Die Patienten werden vom 1.5.2019 bis 31.12.2020 rekrutiert. Die rekrutierten Patienten werden sowohl eine schriftliche Einverständniserklärung für diese Studie als auch eine Einverständniserklärung der Helsinki Biobank vorlegen, die Plasma- und chirurgische Proben abdeckt. Die Teilnehmer können die Einwilligung jederzeit während der Studie widerrufen. Die Biobank-Proben werden gleichzeitig mit klinischen Proben entnommen, wodurch der zusätzliche Schaden für die Teilnehmer minimiert wird. Eine Genehmigung des Institution Review Board des Helsinki University Hospital (HUS) (HUS 60/2019) und eine ethische Erklärung wurden erteilt (455/2019). Die Studie wird in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

Patienten

Die Patienten werden vor der Operation aus dem präoperativen Treffen des multidisziplinären Teams (MDT) rekrutiert. Das Einschlusskriterium in diese Studie ist ein histologisch bestätigtes NSCLC, das für eine chirurgische Behandlung geeignet und naiv für systemische onkologische Behandlungen ist, wobei entweder formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe oder frisch gefrorene Gewebeproben verfügbar sind.

Die klinischen Patientendaten werden zu jedem Zeitpunkt (z. präoperativ, operativ, Nachsorge). Jeder Patient wird in MDT-Gesprächen vor und nach der Operation evaluiert, wo sowohl das klinische als auch das pathologische Stadium bestimmt wird. Darüber hinaus wird das radiologische Konsolidierungs-/Tumorverhältnis aus präoperativen Computertomographie (CT)-Scans berechnet. Diese Daten werden an eine sichere, zertifizierte elektronische Datenbank (Granitics Unify Med) übertragen, auf die nur Forscher der Gruppe Zugriff haben.

Entnahme von Blut- und Gewebeproben

Die Blut- und Gewebeproben werden gleichzeitig mit klinischen Proben entnommen. Die Forscher zielen darauf ab, chirurgisch entfernte Gewebeproben sowie präoperative und nachsorgende cfDNA-Proben von allen Patienten zu sammeln. Zusätzlich zu chirurgischen Proben werden Gewebeproben von metastatischen Läsionen gesammelt, einschließlich Autopsieproben von verstorbenen Patienten. Falls noch nicht geschehen, wird die Standard-Biobank-Blutprobe gleichzeitig mit präoperativen Proben entnommen.

Plasmaproben werden zum Zeitpunkt der klinischen Blutproben des Patienten entnommen. Eine präoperative Probe wird 1-2 Tage vor der Operation entnommen. Die erste postoperative Kontrollprobe wird beim Operationsbesuch 4-6 Wochen nach der Operation entnommen. Die zweite und dritte Nachsorgeprobe wird nach 6 und 12 Monaten während des klinischen Nachsorgebesuchs entnommen. Zu jedem Zeitpunkt werden cfDNA-Proben in doppelte spezialisierte Sammelröhrchen gesammelt, die Fixiermittel enthalten, um DNA vor Fragmentierung zu stabilisieren (2 x 10 ml Streck cfDNA BCT). Die Blutprobe wird zentrifugiert, um Plasma zu extrahieren. Plasma- und Gewebeproben werden bei -80 Grad Celsius in der Helsinki Biobank gelagert.

Studienergebnisse Präoperative ctDNA-Mutationen werden mit klinisch wichtigen Endpunkten wie krankheitsfreiem Überleben, Tumorgröße, Histologie, TNM-Stadium und Gesamtüberleben abgeglichen. Das klinische Krebsrezidiv wird aus radiologischen oder Tumorgewebeproben gewonnen. Das krankheitsfreie Überleben wird von der Operation bis zum Wiederauftreten der Krankheit bei MDT-Meetings oder bis zum Tod bewertet. Das Gesamtüberleben wird von der Operation bis zum Tod als Folge einer beliebigen Ursache bewertet.

Genetische Analyse

Quantitative und mutationsspezifische ctDNA-Analysen werden über ein Tumor-/somatisches Exom-Genom-Panel durchgeführt, das 23.000 Gen-Panel mit 50 Millionen Basen umfasst. Die Keimbahn-DNA-Isolierung erfolgt aus dem Buffy-Coat, das aus der Blutprobe des Patienten entnommen wurde (B-Bio-0). Um echte somatische Mutationen zu erreichen, wird zunächst die Keimbahnvariation aus der ctDNA deletiert. Zweitens wird ctDNA mit Tumorgewebe-DNA-Mutationen verglichen, um falsch positive Befunde auszuschließen. Drittens werden ähnliche oder neue Mutationen, die aus Nachsorgeproben gesammelt wurden, verwendet, um eine postoperative Resterkrankung oder ein Wiederauftreten von Krebs zu erkennen.

Die Sequenzierung wird in Zusammenarbeit mit dem Institute for Molecular Medicine Finland (FIMM) mit seinem proprietären Gen-Paneling durchgeführt.