Лечение диабетической стопы аутологичными эндотелиальными клетками-предшественниками

Дизайн исследования Исследование представляло собой проспективное нерандомизированное исследование, проведенное в 2 центрах в восточном Китае - Десятой народной больнице Университета Тунцзи и Первой больнице Нанкина. Этический комитет в каждом центре утвердил протокол, и все пациенты дали письменное информированное согласие. Все зарегистрированные пациенты были распределены в группу лечения клетками CD133+ (группа CD133+) и контрольную группу по собственному желанию. Это исследование предназначено для оценки эффективности и иммунорегуляторного воздействия внутриартериальной инфузии аутологичных клеток CD133+ у пациентов с диабетом и ЗПА.

Включение и группировка пациентов Пациенты с ЗПА с диабетом в возрасте ≥18 лет и категориями по Резерфорду со 2 по 5 были включены для оценки права на участие в этом исследовании. Все пациенты, давшие согласие на участие в исследовании, могли добровольно выбрать, получать или нет лечение аутологичными клетками-предшественниками CD133+.

В этом исследовании клетки CD133+ использовались для стимуляции ангиогенеза и восстановления эффективного микрососудистого кровоснабжения, поэтому сходный гемодинамический статус в основной ветви был необходим для достижения гомогенности в обеих группах перед включением пациентов. Кандидаты, у которых внутрипросветная реваскуляризация подвздошной (подвздошной и бедренно-подколенной) и 1 подколенной (передней/задней большеберцовой, малоберцовой) артерий пораженной конечности оказалась неудачной, исключались из исследования.

Другими критериями исключения были следующие: ① гемоглобин < 10 мг/дл, ② клиренс креатинина < 30 мл/мин, ③ предшествующая история терапии стволовыми/прогениторными клетками, ④ паралич из-за заболевания центральной нервной системы, ⑤ случайная ампутация или перелом кости целевая конечность из-за травмы после входа, ⑥ прекращение приема антитромбоцитарных препаратов после входа, ⑦ курение или повторное курение после входа, ⑧ злокачественная опухоль.

Лечение поражений инфрааорты и подколенных артерий Компьютерно-томографическую ангиографию (КТА) выполняли сначала для анализа состояния сосудистого поражения, а затем выполняли цифровую субтракционную ангиографию (ЦСА) для точной идентификации поражений инфрааорты и инфра- подколенные артерии до лечения.

Лечение поражений инфрааортальных артерий выполнялось ограниченно внутрипросветным методом (баллонная дилатация и/или имплантация стента), однако степень поражения соответствовала классификации TASC II. Артериальный интродьюсер вводили в контралатеральную бедренную артерию, затем антеградным доступом выполняли реваскуляризацию конечности-мишени.

После предыдущей процедуры поражения подколенных артерий были повторно оценены с помощью DSA. С помощью баллонной дилатации, по крайней мере, одна из передней/задней большеберцовой и малоберцовой артерий достигла очевидного прямого кровоснабжения стопы.

Целью вышеописанных процедур является полное восстановление нормального гемодинамического статуса основного ствола конечности-мишени.

Сбор и подготовка аутологичных клеток CD133+ После успешной реваскуляризации инфрааорты и подколенной артерии у пациентов было взято 100 мл периферической крови через оболочку бедренной артерии и отправлено в Восточно-Китайский банк стволовых клеток для сортировки и обогащения клеток CD133+. Мононуклеарные клетки выделяют из цельной крови центрифугированием в градиенте плотности с разделяющей средой Фиколл, затем отбирают клетки CD133+ с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток. Отобранные клетки смешивали с 50 мл инъекционного раствора хлорида натрия, который содержит человеческий альбумин и гепарин натрия в пакете с кровью, а затем отправляли обратно в больницу при температуре 4℃. Все процедуры сбора и подготовки были завершены в течение 6 часов.

Выбранные клетки также должны пройти тест на качество, иначе клетки будут выброшены, а исходный пациент будет исключен из исследования. Стандарты качества следующие: число клеток ≥ 1×107, отсутствие видимого преципитата в клеточной суспензии, жизнеспособные клетки ≥90%, эндотоксин ≤ 2EU/мл Процедура инфузии клеток Катетер вводили в подколенную артерию целевой конечности на плато большеберцовой кости. уровень. Суспензию клеток CD133+ набирали в шприц на 50 мл и вводили через катетер с помощью инъекционного насоса в течение 30 минут.

В контрольной группе через катетер вводили 50 мл бесклеточной инъекции хлорида натрия, содержащей человеческий альбумин и гепарин натрия, в качестве плацебо.

Медикаментозное лечение и изменение образа жизни Обеим группам было предложено постоянно принимать лекарства от диабета, гиперлипидемии и гипертонии по рекомендации специализированных врачей. Также требовалась антитромбоцитарная терапия 100 мг аспирина, покрытого кишечнорастворимой оболочкой, и 75 мг клопидогреля ежедневно, а также назначение статинов для стабилизации артериальных бляшек.

Помимо этих лекарств, всех кандидатов строго попросили бросить курить после поступления.

Последующее наблюдение и конечные точки Пациенты наблюдались через 18 месяцев. Первичные конечные точки были определены как обострение язвы (развитие новых или больших или более глубоких язв) и ампутация (выше плюсневого уровня). Заживление язвы и статус ампутации наблюдали ежемесячно.

Изменение классификации Rurtherford, TcPO2 тыльной поверхности стопы и ЛПИ регистрировали для оценки перфузии крови конечности через 6 и 18 месяцев в качестве вторых конечных точек.

Доказано, что стволовые клетки способствуют ангиогенезу посредством стимуляции пролиферации, миграции и выживания эндотелиальных клеток за счет паракринного высокого уровня сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) [9]. В дополнение к регенеративным свойствам стволовые клетки обладают иммунорегуляторной способностью и вызывают иммунодепрессивные эффекты в ряде ситуаций [10]. Было обнаружено, что стволовые клетки человека подавляют экспрессию интерлейкина-6 (ИЛ-6) в активированных макрофагах, что играет ключевую роль в воспалительной реакции при заживлении ран [11]. Таким образом, сывороточные концентрации VEGF и IL-6 до и через 1, 2, 4 недели после инфузии клеток CD133+ были протестированы для оценки проангиогенного и иммунорегуляторного воздействия процедуры и ее продолжительности.