Autologiczne komórki progenitorowe śródbłonka Leczenie stopy cukrzycowej

Projekt badania Badanie było prospektywnym, nierandomizowanym badaniem przeprowadzonym w 2 ośrodkach we wschodnich Chinach – Dziesiątym Szpitalu Ludowym Uniwersytetu Tongji i Pierwszym Szpitalu Nanjing. Komisja etyczna w każdym ośrodku zatwierdziła protokół, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę. Wszyscy włączeni pacjenci zostali przypisani z własnej woli do grupy leczonej komórkami CD133+ (grupa CD133+) i grupy kontrolnej. Niniejsze badanie ma na celu ocenę skuteczności i wpływu immunoregulacyjnego dotętniczego wlewu autologicznych komórek CD133+ u chorych na cukrzycę z PAD.

Włączanie i grupowanie pacjentów Pacjenci z PAD w wieku ≥18 lat z kategoriami Rutherforda od 2 do 5 zostali włączeni w celu oceny kwalifikacji do tego badania. Wszyscy pacjenci, którzy zgodzili się wziąć udział w badaniu, mogli dobrowolnie zdecydować, czy chcą otrzymać leczenie autologicznymi komórkami progenitorowymi CD133+.

W tym badaniu komórki CD133+ wykorzystano do stymulacji angiogenezy i odbudowy wydajnego ukrwienia mikrokrążenia, dlatego podobny stan hemodynamiczny w gałęzi głównej był niezbędny do osiągnięcia jednorodności w obu grupach przed przyjęciem pacjenta. Kandydaci, u których nie powiodła się śródnaczyniowa rewaskularyzacja tętnicy podaortalnej (biodrowej i udowo-podkolanowej) oraz 1 tętnicy podkolanowej (piszczelowej przedniej/tylnej, strzałkowej) kończyny zajętej, byliby wykluczeni z badania.

Kolejnymi kryteriami wykluczenia były: ① Hemoglobina < 10 mg/dl, ② klirens kreatyniny < 30 ml/min, ③ przebyta terapia komórkami macierzystymi/progenitorowymi, ④ porażenie spowodowane chorobą ośrodkowego układu nerwowego, ⑤ przypadkowa amputacja lub złamanie kości kończyna docelowa z powodu urazu po wejściu, ⑥ zaprzestanie przyjmowania leków przeciwpłytkowych po wejściu, ⑦ palenie lub ponowne palenie po wejściu, ⑧ nowotwór złośliwy.

Leczenie zmian w tętnicy podaortalnej i podkolanowej Wykonano angiografię tomografii komputerowej (CTA) w celu wstępnej analizy stanu zmiany naczyniowej, a następnie cyfrową angiografię subtrakcyjną (DSA) w celu dokładnego zidentyfikowania zmian w tętnicy podaortalnej i podkolanowej tętnice podkolanowe przed leczeniem.

Leczenie zmiany w tętnicy podaortalnej prowadzono w ograniczonym zakresie techniką do światła naczynia (dylatacja balonem i/lub implantacja stentu), jednak stopień zmiany był zgodny z klasyfikacją TASC II. Osłonkę tętniczą wprowadzano do tętnicy udowej przeciwstronnej, a następnie rewaskularyzację kończyny docelowej wykonywano z dostępu antegrade.

Po poprzednim zabiegu dokonano ponownej oceny zmian w tętnicach podkolanowych za pomocą DSA. Za pomocą dylatacji balonowej co najmniej jedna z tętnic piszczelowych przednich/tylnych i tętnic strzałkowych uzyskała oczywisty bezpośredni dopływ krwi do stopy.

Celem powyższych zabiegów jest całkowite przywrócenie prawidłowego stanu hemodynamicznego tułowia kończyny docelowej.

Pobieranie i przygotowanie autologicznych komórek CD133+ Po udanej rewaskularyzacji procedur podaortalnych i podkolanowych, pobrano od pacjentów 100 ml krwi obwodowej przez pochewki tętnicy udowej i wysłano do Banku Komórek Macierzystych Wschodnich Chin w celu sortowania i wzbogacenia komórek CD133+. Komórki jednojądrzaste są oddzielane od krwi pełnej przez wirowanie w gradiencie gęstości z podłożem rozdzielającym Ficoll, następnie selekcjonuje się komórki CD133+ stosując sortowanie komórek aktywowane magnetycznie. Wybrane komórki zmieszano z 50 ml chlorku sodu do wstrzyknięcia, który zawiera ludzką albuminę i heparynę sodową w worku z krwią, a następnie odesłano do szpitala w temperaturze 4 ℃. Wszystkie procedury pobierania i przygotowania zostały zakończone w ciągu 6 godzin.

Wybrane komórki muszą również przejść test jakości, w przeciwnym razie komórki zostaną odrzucone, a pacjent źródłowy zostanie wykluczony z badania. Standardy jakości są następujące: liczba komórek ≥ 1×107, brak widocznego osadu w zawiesinie komórek, żywe komórki ≥90%, endotoksyna ≤ 2EU/ml Procedura infuzji komórek Cewnik wprowadzono do tętnicy podkolanowej kończyny docelowej na poziomie plateau kości piszczelowej poziom. Zawiesinę komórek CD133+ wciągnięto do 50 ml strzykawki i wlano przez cewnik za pomocą pompy iniekcyjnej w czasie do 30 minut.

W przypadku grupy kontrolnej przez cewnik wstrzyknięto 50 ml wolnego od komórek roztworu chlorku sodu zawierającego albuminę ludzką i sól sodową heparyny jako placebo.

Leki i zmiana stylu życia Obie grupy zostały poproszone o ciągłe przyjmowanie leków przeciwcukrzycowych, hiperlipidemii i nadciśnienia tętniczego zgodnie z zaleceniami lekarzy specjalistów. Zalecono również leczenie przeciwpłytkowe 100 mg kwasu acetylosalicylowego powlekanego dojelitowo i 75 mg klopidogrelu dziennie oraz podawanie statyn w celu stabilizacji blaszki tętniczej.

Oprócz tych leków wszyscy kandydaci zostali poproszeni o rzucenie palenia po wejściu.

Obserwacja i punkty końcowe Pacjentów obserwowano po 18 miesiącach. Pierwszorzędowe punkty końcowe zdefiniowano jako zaostrzenie owrzodzenia (powstanie nowych lub większych lub głębszych owrzodzeń) oraz amputację (powyżej poziomu śródstopia). Stan gojenia się wrzodów i amputacji obserwowano co miesiąc.

Jako drugie punkty końcowe zarejestrowano zmianę klasyfikacji Rurtherforda, TcPO2 grzbietu stopy i ABI w celu oceny perfuzji krwi kończyny po 6 i 18 miesiącach.

Jak udowodniono, komórki macierzyste promują angiogenezę poprzez stymulację proliferacji, migracji i przeżycia komórek śródbłonka przez parakrynny wysoki poziom czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) [9]. Oprócz właściwości regeneracyjnych, komórki macierzyste mają zdolność immunoregulacyjną i wywołują efekty immunosupresyjne w szeregu sytuacji [10]. Stwierdzono, że ludzkie komórki macierzyste hamują ekspresję interleukiny-6 (IL-6) w aktywowanych makrofagach, która odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi zapalnej w gojeniu się ran [11]. Zbadano zatem stężenia VEGF i IL-6 w surowicy przed i po 1, 2, 4 tygodniu po infuzji komórek CD133+ w celu oceny proangiogennego i immunoregulacyjnego wpływu procedury oraz czasu jej trwania.