Trattamento delle cellule progenitrici endoteliali autologhe del piede diabetico

Disegno dello studio Lo studio era uno studio prospettico, non randomizzato, condotto presso 2 centri nella Cina orientale: il Tenth People's Hospital dell'Università di Tongji e il Nanjing First Hospital. Il comitato etico di ciascun centro ha approvato il protocollo e tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto. Tutti i pazienti arruolati sono stati assegnati al gruppo di trattamento delle cellule CD133+ (gruppo CD133+) e al gruppo di controllo di propria volontà. Questo studio ha lo scopo di valutare l'efficacia e l'impatto immunoregolatorio dell'infusione intra-arteriosa di cellule autologhe CD133+ su soggetti diabetici con PAD.

Arruolamento e raggruppamento dei pazienti Pazienti diabetici affetti da PAD di età ≥18 anni con categorie di Rutherford da 2 a 5 sono stati inclusi per valutare l'ammissibilità a questo studio. Tutti i pazienti, che hanno accettato di partecipare allo studio, hanno potuto scegliere volontariamente se ricevere o meno il trattamento con cellule progenitrici CD133+ autologhe.

In questo studio, le cellule CD133+ sono state utilizzate per stimolare l'angiogenesi e ricostruire un efficiente afflusso di sangue microvascolare, pertanto uno stato emodinamico simile nel ramo principale era essenziale per raggiungere l'omogeneità in entrambi i gruppi prima dell'ingresso del paziente. I candidati che hanno fallito la rivascolarizzazione intraluminale delle arterie infra-aorta (iliaca e femorale-poplitea) e 1 infra-poplitea (tibiale anteriore/posteriore, fibulare) dell'arto interessato, verrebbero esclusi dallo studio.

Altri criteri di esclusione erano i seguenti: ① Emoglobina < 10 mg/dl, ② clearance della creatinina < 30 ml/min, ③ storia precedente di terapia con cellule staminali/progenitrici, ④ paralisi dovuta a malattia del sistema neurale centrale, ⑤ amputazione accidentale o frattura ossea di arto bersaglio a causa del trauma dopo l'ingresso, ⑥ interruzione del trattamento antipiastrinico dopo l'ingresso, ⑦ fumo o rifumo dopo l'ingresso, ⑧ tumore maligno.

Trattamento della lesione dell'arteria infra-aortica e infra-poplitea È stata eseguita l'angiografia tomografica computerizzata (CTA) per analizzare in primo luogo la condizione della lesione vascolare e quindi è stata eseguita l'angiografia a sottrazione digitale (DSA) per identificare con precisione le lesioni dell'infra-aorta e dell'arteria infra-poplitea arterie poplitee prima del trattamento.

Il trattamento della lesione dell'arteria infra-aortica è stato eseguito limitatamente con tecnica intraluminale (dilatazione del palloncino e/o impianto di stent) nonostante il grado della lesione secondo la classificazione TASC II. La guaina arteriosa è stata introdotta nell'arteria femorale controlaterale, quindi è stata eseguita la rivascolarizzazione dell'arto bersaglio mediante approccio anterogrado.

Dopo la procedura precedente, le lesioni delle arterie infrapoplitee sono state rivalutate mediante DSA. Mediante la dilatazione con palloncino, almeno una delle arterie tibiale e fibulare anteriore/posteriore raggiungeva un evidente afflusso di sangue diretto al piede.

L'obiettivo delle procedure di cui sopra è ripristinare completamente il normale stato emodinamico del tronco principale dell'arto bersaglio.

Raccolta e preparazione di cellule autologhe CD133+ Dopo la riuscita rivascolarizzazione della procedura infra-aortica e infra-poplitea, 100 ml di sangue periferico sono stati raccolti attraverso la guaina dell'arteria femorale nei pazienti e inviati alla Banca delle cellule staminali della Cina orientale per lo smistamento e l'arricchimento delle cellule CD133+. Le cellule mononucleate vengono separate dal sangue intero mediante centrifugazione in gradiente di densità con mezzo di separazione Ficoll, quindi le cellule CD133+ vengono selezionate mediante selezione cellulare attivata magneticamente. Le cellule selezionate sono state miscelate con un'iniezione di cloruro di sodio da 50 ml, che contiene albumina umana ed eparina sodica nella sacca di sangue, e quindi rispedite all'ospedale conservate a 4 ℃. Tutte le procedure di raccolta e preparazione sono state completate entro 6 ore.

Le cellule selezionate devono anche sottoporsi a un test di qualità, altrimenti le cellule verrebbero scartate e il paziente di origine verrebbe escluso dallo studio. Gli standard di qualità sono i seguenti: numero di cellule ≥ 1×107, nessun precipitato visibile nella sospensione cellulare, cellule vitali ≥90%, endotossina ≤ 2EU/ml Procedura di infusione cellulare È stato introdotto un catetere nell'arteria poplitea dell'arto bersaglio nel piatto tibiale livello. La sospensione di cellule CD133+ è stata aspirata in una siringa da 50 ml e infusa attraverso il catetere mediante una pompa di iniezione temporizzata a 30 minuti.

Per il gruppo di controllo, 50 ml di cloruro di sodio privo di cellule contenenti albumina umana ed eparina sodica sono stati infusi attraverso il catetere come placebo.

Farmaci e cambiamento dello stile di vita Ad entrambi i gruppi è stato chiesto di ricevere farmaci continui per il diabete, l'iperlipidemia e l'ipertensione sotto la consulenza di medici specializzati. È stato richiesto anche il trattamento antipiastrinico con 100 mg di aspirina con rivestimento enterico e 75 mg di clopidogrel al giorno, nonché la somministrazione di statine per stabilizzare la placca arteriosa.

Oltre a questi farmaci, a tutti i candidati è stato chiesto in modo restrittivo di smettere di fumare dopo l'ingresso.

Follow-up ed endpoint I pazienti sono stati seguiti a 18 mesi. Gli endpoint primari sono stati definiti come l'aggravamento dell'ulcera (sviluppo di ulcere nuove o più grandi o più profonde) e l'amputazione (al di sopra del livello metatarsale). La guarigione dell'ulcera e lo stato di amputazione sono stati osservati mensilmente.

Il cambiamento della classificazione di Rurtherford, TcPO2 del dorso del piede e ABI sono stati registrati per valutare la perfusione sanguigna dell'arto a 6 e 18 mesi come secondo endpoint.

Come dimostrato, le cellule staminali promuovono l'angiogenesi attraverso la stimolazione della proliferazione, migrazione e sopravvivenza delle cellule endoteliali da parte di paracrine di alti livelli di fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) [9]. Oltre alle proprietà rigenerative, le cellule staminali hanno una capacità immunoregolatrice e inducono effetti immunosoppressivi in ​​una serie di situazioni [10]. È stato scoperto che le cellule staminali umane sopprimono l'espressione dell'interleuchina-6 (IL-6) nei macrofagi attivati, che svolge un ruolo chiave nella risposta infiammatoria nella guarigione delle ferite [11]. Pertanto, le concentrazioni sieriche di VEGF e IL-6 prima ea 1, 2, 4 settimane dopo l'infusione di cellule CD133+ sono state testate per valutare l'impatto pro-angiogenetico e immunoregolatorio della procedura e la sua durata.