A KCTD fehérjecsalád szerepének feltárása a gyermekkori akut limfoblasztos leukémiák klinikai kezelésében

Gyermekkori akut limfoblasztos leukémiás betegek

akut limfoblasztos leukémiában szenvedő 1-16 éves gyermekek

Egyéb: megfigyeléses vizsgálat

a kérdéses biomarkerek (DNS-RNS és fehérjék) elemzése az alanyok véréből tisztított MNC-ben

egészséges alanyok

Egészséges donoroktól származó köldökzsinórvér, amely klinikai célokra nem használható fel

Egyéb: megfigyeléses vizsgálat

a kérdéses biomarkerek (DNS-RNS és fehérjék) elemzése az alanyok véréből tisztított MNC-ben

KCTD expressziós szintek, RNAseq megközelítéssel, a B- és T-sejtes ALL-betegek csoportjában a nem érintett kontrollokhoz képest

A projekt során körülbelül 15-20 B-ALL és 3-6 T-ALL beteget veszünk fel. Az RNAseq kísérleteket a transzkriptom elemzéshez legalább 8 B-ALL betegből és 3-4 T-ALL betegből álló vizsgálati csoporton végezzük el. , és a köldökzsinórvérből tisztított naiv B- vagy T-sejtek a B- és a T-ALL kontrolljaként. Nyers számlálásokat használunk, és empirikus Bayes megközelítést alkalmazunk (DESeq2, R csomag). Az eredmények minden gén esetében tartalmazzák a log-szeres változást (log2), az alapátlagot, a p-értéket és a korrigált p-értékeket (Benjamimi-Hochberg). A DEgenes kimenetét az IPA Ingenuity pathway AnalysisSoftware (Qiagen) számára megfelelő formátumba exportálják a génjegyzetek, a funkcionális elemzés és a biomarkerek előrejelzésére. A B-ALL-ben és T-ALL-ben deregulált KCTD-fehérjéket részletesen tanulmányozzuk.

A deregulált KCTD-k RT-PCR validálása és a lehetséges KCTD-kölcsönhatások azonosítása leukémiában funkcionális proteomikai megközelítéssel

A transzkriptom adatok értelmezése után specifikus validációs kísérleteket végzünk reat-time pcr, westernblot, áramlási citometria és mikroszkóp segítségével. Röviden, a teljes RNS-t körülbelül 5e6 teljes MNC-ből tisztítjuk és használjuk fel RT-PCR kísérletekhez; BM-kenetet vesznek a deregulált KCTD-k immunfluoreszcens elemzéséhez; az összfehérje-kivonatot legalább 1 e 6 össz-MNC-ből nyerjük, és -80 °C-on tároljuk a Western-blotozásig; végül élő mononukleáris sejteket kezelünk a kérdéses KCTD-k permeabilizálására és citoplazmatikus immunfestésére. Minden kísérletet B- és T-ALL in vitro humán modellrendszereken végeznek, majd betegeken és kontrollsejteken hajtanak végre. Ezen túlmenően, a KCTD-fehérjék lehetséges interakcióinak azonosítása érdekében B-ALL és T-ALL sejtvonalakat használunk a funkcionális proteomikai analízishez.

A B-ALL betegek klinikai adatainak összefüggése a KCTD-k expressziós szintjével

Először is értékelni fogjuk a deregulált KCTD fehérjék hasznosságát a leukémia új markereiként, amelyeket multiparaméteres klinikai áramlási citometriával kell tesztelni. Kutatócsoportunk már kidolgozott egy speciális protokollt, amely képes megfesteni a citoplazmatikus antigéneket (például a KCTD fehérjéket) olyan felületi antigénekkel, amelyeket általában a hematológiai kompartmentek áramlási citometriás vizsgálatára használnak. Ez a megközelítés különösen hasznos a betegek kezelésre adott válaszának nyomon követésében, valamint a minimális reziduális betegség kimutatásában. Ezen túlmenően, mivel képesek vagyunk a citoplazmatikus KCTD-k felszíni antigénekkel kombinációban történő kimutatására, a KCTD-k expressziós szintjének leírását terveztük több sejtpopulációban, amelyek a csontvelőben és a perifériás vérben találhatók. Másodszor, az ebben a vizsgálatban kapott összesített adatokat a páciensre nézve is értelmezzük. klinikákon, különös tekintettel a terápiára adott válaszra, a visszaesés kockázatára és lehetőség szerint a terápiával szembeni rezisztenciára.