Inulina e S. Salivarius riducono l'alitosi

Partecipanti In questo studio clinico di fase II randomizzato, controllato, in doppio cieco, parallelo, sono stati invitati a partecipare pazienti adulti (≥18 anni) che lamentavano alitosi in presenza di patina linguale. Sono stati identificati con inviti sotto forma di poster distribuiti presso gli ambulatori della Dental School, Università di Passo Fundo (UPF), da agosto a novembre 2015. La Dental School si trova nel campus principale di UPF, Passo Fundo, una città con >200.000 abitanti. L'alitosi orale è stata inizialmente diagnosticata mediante esame orale per l'identificazione del rivestimento della lingua, seguito da test organolettici per confermare l'alitosi. La dimensione totale del campione è stata stimata in 45 partecipanti, considerando una differenza dell'80% nella riduzione dell'alimetro tra i trattamenti, per i test con α = 5% e potenza = 80%. L'alitosi è stata definita da valori di Halimeter ≥ 75 ppb. Tutti i partecipanti hanno dato il consenso scritto prima di entrare nello studio. Il protocollo di ricerca è stato approvato dal comitato etico locale (CAAE: 40334914.0.0000.5342).

Esame clinico L'esame orale è stato eseguito da un dentista esperto (CRM), identificando carie dentali, placca, gengivite, tasche parodontali ed eventuali protesi dentarie. Il rivestimento è stato descritto dopo l'ispezione visiva della lingua e l'indice di rivestimento è stato classificato in 4 livelli: 0 - nessun rivestimento; 1 - rivestimento sottile su 1/3; 2 - rivestimento sottile su più di 1/3 o rivestimento spesso solo su 1/3; 3 - rivestimento spesso su più di 1/3,5

Valutazione dell'alitosi Dopo l'esame clinico, l'alitosi è stata quantificata mediante test organolettici e Halimeter‡. Questi sono stati eseguiti da un esaminatore addestrato e calibrato (CRM), con livelli di concordanza e riproducibilità superiori all'80% per il test organolettico e l'indice di rivestimento, utilizzando confronti di test e retest con un giudice esperto (CKR). Tutti i pazienti sono stati esaminati tra le 8 e le 11:00. Ai pazienti è stato chiesto di evitare di mangiare aglio, cipolla e altri condimenti alimentari per due giorni prima del test e di evitare di mangiare troppo margarina, latte, frittura, sardine, salame, mortadella, salsiccia, carne rossa, formaggi, alimenti con zolfo nella composizione (cavolo, broccoli , cavolfiore, uovo), bere alcolici e fumare, seguendo i protocolli riportati altrove.5, 13, 15 Nella mattinata dell'esame, i pazienti dovrebbero evitare di usare caramelle e gengive, ma potevano fare colazione e lavarsi i denti solo con acqua. Una volta inclusi nello studio, ai pazienti è stato chiesto di evitare gengive diverse da quelle fornite nello studio.

Test organolettico I pazienti a riposo sono stati istruiti a trattenere l'aria in bocca mentre respiravano attraverso il naso per 1 minuto. Soffiano attraverso la bocca con l'esaminatore (CRM) posizionato a 10 cm dalla bocca del paziente. Il respiro del paziente è stato valutato da 0 a 5, come segue: 0 - nessun odore, 1 - odore scarso appena percettibile, 2 - leggero odore, 3 - odore moderato, 4 - forte odore e 5 - forte odore.21 Ai fini della selezione dei pazienti, l'alitosi è stata considerata presente quando questo punteggio era uguale o superiore a 1 in presenza di patina linguale.

Halimeter Ai pazienti è stato misurato oggettivamente il respiro utilizzando un Halimeter, in grado di misurare il livello VSC. L'alitosi viene identificata quando il dispositivo registra ≥75 ppb.1, 22 Le misurazioni sono state effettuate inserendo una cannuccia monouso nella bocca del paziente sopra la lingua. Secondo il produttore, il risultato finale è stato ottenuto come media di tre misurazioni.

Prebiotico, probiotico e placebo Lactobacillus salivarius G60, inulina e placebo§ (composto da gomagron) sono stati preparati sotto forma di gomma‖, identici per aspetto fisico, odore, sapore e consistenza costituendo i seguenti gruppi sperimentali: LS+inulina: Lactobacillus salivarius G60 1 miliardo di unità formanti colonia (CFU) + inulina 1 g; LS: Lactobacillus salivarius G60 1 miliardo CFU; e placebo. I pazienti sono stati istruiti a utilizzare 1 gomma da masticare ogni 12 ore (dopo colazione e dopo cena) per 10 giorni.

Valutazione della qualità della vita Per la qualità della vita (QOL) correlata all'uso orale, abbiamo applicato il questionario OHIP-14, tradotto e convalidato in portoghese brasiliano.23 Il punteggio finale va da 0 (migliore) a 56 (peggiore). I partecipanti hanno risposto ai questionari nei giorni 0 e 14.

Protocollo di studio I pazienti sono stati valutati in una clinica odontoiatrica, seguendo i passaggi illustrati nella Figura 2. Dopo aver firmato il consenso informato, sono stati registrati i dati clinici e sulla qualità della vita, seguiti da esame orale per valutare il rivestimento della lingua e test organolettico per confermare l'alitosi. Successivamente, l'Halimeter è stato utilizzato per misurare oggettivamente l'alitosi.

I pazienti arruolati sono stati randomizzati dall'esaminatore (CRM) utilizzando un codice busta generato al computer, organizzato dal produttore di gengive in blocchi per 3 pazienti 1:1:1, ciascuno contenente uno dei 3 trattamenti (LS+inulina, LS e placebo ). Pertanto, l'esaminatore e i partecipanti erano all'oscuro dei trattamenti. I pazienti sono stati istruiti a utilizzare 1 gomma ogni 12 ore a partire dal quarto giorno dopo il colloquio e interrompendo 2 settimane dopo il primo colloquio (10 giorni di trattamento). Questo ritardo di 4 giorni prima dell'inizio del trattamento ha consentito un intervallo di 14 giorni per l'attenuazione del bias di richiamo con OHIP-14. Ogni gengiva è stata posta in bocca per completare la dissoluzione, consentendo una delicata masticazione. L'esame finale è stato eseguito l'ultimo giorno di trattamento, 12 ore dopo aver utilizzato l'ultima gomma, ripetendo l'indice di rivestimento, i test organolettici e Halimeter e la valutazione della qualità della vita (OHIP-14). Le istruzioni sull'igiene orale sono state fornite dall'esaminatore (CRM): ai pazienti è stato chiesto di evitare qualsiasi nuovo approccio che potesse alterare l'alitosi, come la pulizia della lingua o cambiamenti nella routine dello spazzolamento dei denti. L'aderenza al trattamento è stata valutata come il numero di gengive non utilizzate in relazione al numero totale di gengive ricevute. La sicurezza è stata caratterizzata in base agli effetti collaterali descritti dai pazienti, inclusi mal di testa, disturbi orali e sintomi addominali (sì/no). Gli esiti primari erano il test organolettico, l'alimetro e l'indice di rivestimento, mentre gli esiti secondari erano la qualità della vita e l'aderenza/sicurezza del trattamento. L'allocazione nei tre gruppi di trattamento è stata rivelata solo al termine dell'analisi dei dati.

Metabolismo dell'inulina da parte del Lactobacillus salivarius G60 La capacità del Lactobacillus salivarius G60 di metabolizzare l'inulina come fonte di carbonio è stata testata inoculando 50 ml di sospensione batterica LS (1x10⁸-⁹ cellule/ml) in soluzione salina fisiologica tamponata in 5 ml di ambiente semi- definito dal limite di rilevabilità del metodo (LDM) senza glucosio e saccarosio ma integrato con inulina. Sono stati preparati i seguenti terreni di coltura: PYG (lievito peptone + 1% glucosio), PYI (lievito peptone + 1% inulina) e PY (lievito peptone). Quest'ultimo fungeva da controllo negativo. L'LS G60 precedentemente coltivato è stato incluso rispettivamente in queste tre soluzioni ed incubato a 30°C per 24 ore.

Sono state eseguite analisi spettrofotometriche (Genesys 10S VIS, made Madison, USA) utilizzando 600 mm per la densità ottica (OD). Per misurare l'assorbanza, la soluzione con LS G60 è stata regolata a OD=1, secondo la formula C1.V1=C2.V2 (C1: concentrazione iniziale, V1: volume iniziale, C2: concentrazione finale e V2: volume finale). Le misurazioni sono state eseguite all'ora iniziale (zero) e dopo 2, 4, 6, 8, 10 e 12 ore. Tutti i test sono stati ripetuti per conferma.

È stato eseguito il test di inibizione dei batteri patogeni da parte di Lactobacillus salivarius G60 Well diffusion test. Tre gocce di 10 ml di sospensione batterica (1x10⁸-⁹ cellule/ml di LS G60) in soluzione salina tamponata sono state poste in agar triptico di soia e incubate a 30°C per 3 ore in condizioni anaerobiche ottimali. Le piastre sono state coperte con 10 ml di soft soy triptic agar (0,7% agar) e inoculate con 1 ml di sospensione batterica (1x10⁸-⁹ cellule/ml) in soluzione salina tamponata di patogeni che causano alitosi (Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia) in condizioni anaerobiche condizioni. Sono state incubate a 30°C e le zone di inibizione dell'alone di crescita microbica attorno alle goccioline sono state esaminate a 24, 48 e 72 ore.

Analisi statistica I dati sono stati analizzati statisticamente da uno degli autori (SMCJ) all'oscuro degli interventi. I confronti iniziali tra i gruppi di pazienti sono stati effettuati utilizzando i test ANOVA (età) e chi-quadrato (sesso). I valori del trattamento nei giorni 0 e 14 sono stati prima confrontati in ciascun gruppo mediante test Wilcoxon o t per dati appaiati. Abbiamo utilizzato modelli lineari generalizzati (GZLM) per confrontare i mezzi di trattamento aggiustati per i valori pre-intervento. L'inclusione di genere o età covariabile è stata decisa in base all'indice di Akaike. Il genere è entrato come covariabile nell'analisi di Halimeter, l'età è stata inclusa nei modelli per OHIP-14, mentre nessuna covariabile è stata utilizzata durante l'analisi del punteggio organolettico. Abbiamo utilizzato la distribuzione Gama e il collegamento log per le analisi di Halimeter e OHIP-14, nonché la distribuzione Poisson e il collegamento log per i punteggi organolettici e l'indice di rivestimento. La costante 1 è stata aggiunta ai valori OHIP-14 per renderli suscettibili all'uso dei logaritmi. I confronti multipli a coppie tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando la differenza minima significativa. I risultati della metabolizzazione dell'inulina da parte del Lactobacillus salivarius G60 sono stati analizzati utilizzando il test post hoc ANOVA e Tukey. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando i software Graph Prism 4.0 e SPSS v.18. Il limite considerato per la significatività statistica era del 5%.