慢性移植物抗宿主病 (GVHD) 患者的眼表疾病

干眼症是一种多因素疾病，在眼科实践中经常遇到。 常见的干眼症状包括眼睛刺激、眼睑沉重、视力模糊和光敏感 (1)。 干眼症的全球患病率普遍较高 (2-4)。 在亚洲，干眼症可能会影响中国 (5) 和日本 (3) 40 岁以上的 22% 的成年人。 在 65 岁以上的亚洲患者中，如果诊断是基于异常的泪液稳定性，干眼症的患病率可高达 80%，或高达 60% 的睑板腺功能障碍 (MGD)，这是泪液不稳定的主要原因（ 6).

大多数干眼症患者可以通过润滑剂、泪点阻塞、类固醇和/或环孢菌素滴眼液成功治疗。 然而，一些患有严重干眼症并可能患有移植物抗宿主病 (GVHD) 等基础疾病的患者，他们已经用尽了常规治疗方法，每年可能会达到 10-20 例，并且难以管理。 面对这些情况，这些患者和他们的医生都束手无策。

造血干细胞移植 (SCT) 已被确定为血液系统恶性肿瘤的潜在治疗方法 (9)。 在过去的 2 十年中，全球 SCT 接受者的数量呈指数级增长。 GVHD 是接受同种异体 SCT 的患者发病率和死亡率的主要原因 (10)。

与慢性 GVHD 相关的干眼症是异基因 SCT 后主要的晚期并发症之一；它对患者的生活质量 (11-13) 有重大影响，并可能导致失明 (14)。 与慢性 GVHD 相关的干眼症的免疫过程在很大程度上仍然未知，但据信是对受体组织的传统同种异体反应。

研究人员建议与新加坡中央医院血液科合作，重点研究更严重的慢性 GVHD 患者眼表炎症的临床特征和免疫学特征。 与特发性干眼症相比，SNEC 的慢性 GVHD 患者干眼症严重程度更高。 这可能是由于转诊偏倚，也可能与全身性疾病有关。 因此，研究人员打算进行一项初步研究，以确定非转诊血液病 GVHD 患者的一些眼部特征。 研究人员建议筛选并招募 30 名患有慢性 GVHD 的合适参与者。 要进行的测试将包括眼部成像 (Oculus K5M)、眼部免疫学概况（结膜免疫细胞）和眼表炎症（MMP-9 泪液标记）。

1 假设和目标

因此，本研究旨在通过研究结膜细胞以及结膜发红和泪液稳定性的临床成像来分析慢性 GVHD 患者的眼表炎症。 因此，研究人员希望在 GVHD 结膜样本中发现炎症细胞数量增加。

具体目标：

1. 确定 GVHD 患者的眼部免疫学特征（结膜免疫细胞）并与全身状态（治疗）相关联。
2. 确定 GVHD 患者泪液功能障碍/眼表炎症的客观测量是否异常，并与全身状态相关。

结果：

• 干眼症状（SPEED 问卷）
• 撕裂生产
• 结膜免疫细胞概况（T淋巴细胞和其他免疫细胞的比例）
• 眼表临床参数（结膜发红、非侵入性泪膜破裂时间、角膜荧光素染色）

长期目标：

1. 建立筛查 cGVH 患者转诊至眼科专家的标准。
2. 确定 cGVH 干眼病例的纵向结果、全身预防性治疗以及其他眼部治疗（例如血浆置换滴眼液）的效果。

1.1.1 潜在风险 研究人员将预计本研究涉及的风险和不适最小。

• 使用印模膜对结膜细胞进行取样时可能会有一些轻微的不适
• 撕裂带测微仪有些轻微不适
• 在使用 InflammaDry 测试套件时，参与者可能会感到轻微刺激，因为它需要在参与者的下眼睑上放置一个由吸水材料制成的软垫以收集眼泪。
• 局部麻醉剂（Alcaine）引起的刺痛感

1.1.2 潜在的好处 随着对各种炎症介质存在的更多了解，研究人员可以进一步了解慢性 GVHD 患者发生的复杂过程。

2 研究人群 3.1 列出要登记的受试者的数量和性质。 将从位于新加坡中央医院血液科 1 楼 7 座的移植中心筛选和招募 30 名符合条件的 GVHD 患者。

3.2 招聘标准和招聘流程

1. 受试者符合所有纳入标准
2. 清除排除标准。

在招募受试者之前，将征求 SGH 血液科主治医生的许可。 符合条件的受试者将接受有关该研究的咨询。 如果受试者有兴趣，将从所有参与者那里获得知情的书面同意。 之后，SERI 研究验光师将在 SGH 移植中心进行眼部检查。

4 研究设计

4.1.1 学习程序

考试将由 SERI 研究小组成员完成。 所需考试清单如下所示：

1. 干眼症状（SPEED 问卷）
2. 无创撕裂时间 (NIKBUT) - Oculus K5M
3. 结膜发红- Oculus K5M
4. Tear Strip Meniscometry (SMTube)、Schirmers 测试
5. 撕裂 MMP-9 结果（Inflammadry）
6. 印象细胞学-使用EyePrim结膜
7. 角膜荧光素染色 - Oculus K5M

手续详情

1. 干眼症问卷参与者将被要求对干眼症问卷进行评分，以评估干眼症的症状严重程度及其对过去两周日常活动的干扰程度。

   • SPEED 问卷 包括 2 个关于频率和严重程度的问题，频率等级为 0-3，严重程度等级为 0-4。 调查问卷允许患者从 0 开始评分，0 表示从不，3 表示经常出现问题，0 表示没有问题，4 表示严重程度无法忍受。

2. 非侵入性撕裂时间 (NIBUT) Oculus keratographer 5M（Oculus，Wetzlar，德国）将用于执行非侵入性撕裂时间。 患者将舒适地坐在仪器前并自由眨眼，同时注视正前方的目标。 一旦患者准备就绪，将指示患者眨眼两次并避免眨眼。 Keratograph 5M 是全自动的，它会捕捉图像中的任何破损或变形，并记录破损时间。 每只眼睛将读取三个读数以获得平均值。 参与者的泪膜可能更稳定，即泪液破裂时间增加。
3. 使用 Oculus Keratography 5M 成像结膜发红
4. Tear Strip Meniscometry (SMTube) 从无菌袋中取出 SMTube。 握住 SMTube 的中心。 不要触摸染色区域。 将 SMTube 的尖端浸入眼睛的外侧下眼睑泪液半月板 5 秒钟。 采取额外的预防措施，以防止尖端接触患者的结膜。 5 秒后，从下眼睑撕裂半月板中取出 SMTube。 测量染成蓝色的柱子的长度。
5. 泪液 MMP-9 结果（Inflammadry） InflammaDry 测试将在泪液流明检测后进行，因为它评估泪液中的 MMP-9 水平（一种炎症标志物），因此不受反射性撕裂的影响 (15)。 测试条的绒布沿着下眼睑的内衬轻拍多个位置，要求患者眨眼，然后测试条沿着下鼻睑结膜再静置 5 秒。 将采样绒布组装到测试盒体的样品传输窗口中。 然后将吸水头浸入缓冲液中 20 秒。 从缓冲液瓶中取出吸水头，盖上保护盖，将测试平放在水平面上 10 分钟。 一条蓝线表示阴性结果，而两条线（红色和蓝色）的出现表示阳性结果。

6. 印象细胞学（使用 EyePrim 膜）

   i) RPMI 溶液的制备 在无菌生物安全罩中，准备 2 瓶 2ml Eppendorf 管。 右眼和左眼各一管。 用 1.5ml RPMI 溶液填充 2 个试管。 此后，将试管转移到装有冰块的冰盒中，然后转移到位于 SGH 的移植中心，在那里进行印模。

   ii) 麻醉步骤 1：告知参与者他/她可能会经历短暂的刺痛感。 要求参与者将目光向上。 压低下眼睑，将一滴 LA 滴入下睑穹窿。 双眼都这样做。 要求患者轻轻眨眼至少 3 次。 第 2 步：一旦刺痛消退，要求参与者将视线向下。 抬高患者的上眼睑，将一滴 LA 滴在球结膜上，尽可能放在最优越的位置。 双眼都这样做。 要求患者轻轻眨眼至少 3 次。 第 3 步：再次重复第 2 步。 参与者此时不应感觉到眼睛有任何刺痛感。

   iii) 结膜取样 第 1 步：要求参与者将他/她的目光对准颞下方向。 这暴露了上鼻球结膜用于印象。 第 2 步：在该区域涂抹 EyePRIM 膜。 第 3 步：确保膜与结膜良好贴合。 通过向左和向右摇动 EyePRIM 膜来做到这一点。 第 4 步：用类似剥离的动作从结膜上取下膜。 第 5 步：对 EyePRIM 弹簧机构施加更大的力。 在“咔嗒”一声后，膜将从小工具中弹出。 将右眼的膜放入“右”eppendorf 管中。 第 6 步：对颞上球结膜重复上述步骤，这次将参与者的视线引导至鼻下。 将此膜放入“正确的”eppendorf 管中。 这个 eppendorf 管中应该有 2 个膜。 第 7 步：将此试管放入冰盒中。 第 8 步：对另一只眼睛重复第 1-7 步，但将膜放入“左侧”eppendorf 管中。 第 9 步：此时应该有“右”和“左”eppendorf 管，每个管内有 2 个膜，浸入 1.5ml RPMI 培养基中。 将它们放入冰盒中。

   iv) 从膜上分离细胞 使用 10ul 微量移液器吸头，将细胞从膜上刮下来。 确保刮膜的正确一侧（这可以参考膜钩的方向来完成）。 最简单的方法是将膜固定在小瓶管壁上，然后用类似研磨的动作将其刮掉（小瓶管壁是研钵，微量移液器尖端就像研杵）。 对同一个小瓶管中的另一个膜重复上述步骤。 另外，对另一只眼睛重复相同的步骤。 细胞刮取完成后，将 2 个 eppendorf 管放在冰上，并在同一天移交给 Aihua 或 Tanima（学术界 12 级）进行 FAC 分析。

7. 角膜荧光素染色评分