Lipa-genmutation i PED-LIPIGEN (pediatriska FH-personer)

Lysosomalt surt lipas (LAL) kodas av LIPA-genen lokaliserad på kromosom 10q23.3-q23 och består av 10 exoner. LIPA-mRNA (messenger RiboNucleic Acid) (GenBank accessionsnummer NM_000235) är 2782 bp långt och kodar för ett moget protein med 375 rester (GenBank accessionsnummer NP_000226). Sekvenseringen av alla 10 exoner av LIPA-genen kommer att bestå av 10 PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifieringsreaktioner (för de 10 exonerna och den proximala promotorn) följt av 20 sekvensreaktioner (framåt- och omvänd sekvensering) med lämpliga primrar utformade för att inkludera intronen. -exon gränser. Denna analys kommer att utföras på cirka 250 FH pediatriska ämnen enligt projektbeskrivningen.

Sekvenseringsarbetet kommer att utföras med utnyttjande av 2 automatiserade 8 kapillärer automatiserade DNA-sekvenserare (3500 Genetic Analyzer, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien) som för närvarande finns tillgängliga i laboratoriet hos de enheter som är involverade i projektet.

Vid identifiering av orapporterade sekvensvarianter kommer förekomsten av dessa mutationer att bedömas i ett urval av minst 100 normolipidemiska individer av befolkningen, för att definiera om nukleotidförändringarna är sällsynta sekvensvariationer (med en förmodad funktionell effekt) eller representerar vanliga polymorfismer. Vid fynd av sällsynta varianter i de kodande regionerna kommer en in silico-analys att utföras med hjälp av två olika mjukvaror (Polyphen, http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/ och Panther, http://www.pantherdb.org/) för att förutsäga den förmodade skadliga rollen av mutationerna på proteinet. I händelse av introniska varianter kommer den specifikt utformade programvaran Automated Splice Site Analysis att tillämpas (https://www.splice.uwo.ca/).

Förmodade kausala mutationer kommer också att testas för samsegregering i tillgängliga familjer hos drabbade och opåverkade medlemmar.

För att testa effekten av varianter på enzymaktivitet kommer LAL-aktivitet att analyseras med torkad blodfläcksteknik (DBS) med hjälp av hämmarna Lalistat 2 i bärare och icke-bärare av dessa mutationer som tillhör tillgängliga släktingar.