Influenza delle lenti a contatto colorate cosmetiche sulla superficie oculare

3. Metodi Tutti i soggetti sono tenuti a compilare le informazioni di base e rispondere a un questionario di indagine prima e dopo l'uso delle lenti a contatto. I soggetti saranno esaminati e testati prima di essere adattati a lenti a contatto colorate con biomicroscopia con lampada a fessura e colorazione con fluoresceina (Heig Strait, Germania), misurazione della pressione intraoculare mediante pneumotonometro (Topcon® CT-80), rifrattometro (Topcon® KR-8900) , acuità visiva di Snellen non corretta e meglio corretta (UCVA e BCVA), test di Schirmir 1, tempo di rottura del film lacrimale (TBUT), topografia corneale (Bausch & Lomb® Orb IIz) e misurazione della densità delle cellule endoteliali mediante microscopia speculare (Konan Noncon Robo-Sp-9000, Stati Uniti). Gli esami vengono eseguiti anche a 1 settimana, 1, 3 e 6 mesi di utilizzo delle lenti. Durante ogni visita viene compilata una tabella speciale per tutti i soggetti Durante ogni esame, i soggetti verranno osservati per segni di iniezione congiuntivale, ipertrofia papillare congiuntivale, formazione di panno ed epiteliopatia corneale. Questi segni sono classificati come mostrato nella tabella sottostante.

Segni 0=Normale 1=Leggero 2=Moderato 3=Grave Iniezione congiuntivale Nessuno Minimo Evidente Diffuse Dimensione delle papille Nessuno <0,25 mm 0,25-0,5 mm >0.5mm Pannus superficiale Nessun pannus 1 quadrante 2 quadranti >=3 quadranti Epiteliopatia puntata Nessuna <1/3 della cornea 1/3-1/2 della cornea Confluente o con difetto epiteliale

Il test di Schirmir 1 (test di secrezione basale) viene eseguito per 5 minuti e considerato anormale se la striscia filtrante si bagna <5 mm di lunghezza. TBUT di meno di 10 secondi è considerato anormale.

La citologia dell'impronta verrà eseguita prima dell'uso della lente e a 3 e 6 mesi dopo l'uso della lente presso la National Taiwan University. La carta da filtro in nitrocellulosa con una dimensione dei pori di 0,22 μm (Millipore GSWP 04700, Billerica, MA, USA) viene tagliata in strisce (circa 4x8 mm). Dopo l'applicazione di una goccia di anestetico topico (proparacaina 0,5%), le lacrime in eccesso vengono delicatamente assorbite da tamponi di cotone sterili. Le strisce di nitrocellulosa vengono posizionate sulla superficie della congiuntiva limbare. Dopo aver applicato una leggera pressione, le strisce di carta vengono staccate e fissate immediatamente in alcool al 95%. Le strisce vengono quindi colorate con acido periodico-Schiff (PAS; Sigma 395132, Hattiesburg, MS, USA) ed esaminate al microscopio ottico a 40 ingrandimenti e classificate dagli osservatori della maschera seguendo i criteri di Saini et al. Grado 1: piccole cellule epiteliali rotonde con un rapporto nucleo/citoplasma di 1:2. Numero elevato di cellule profondamente positive presenti. Di solito si ottiene un buon foglio confluente di cellule. Grado 2: un buon foglio cellulare costituito da cellule epiteliali poligonali più grandi con un rapporto nucleocitoplasmatico ridotto di 1:3. Cellule caliciformi ridotte di numero, ma ancora profondamente PAS-positive. Grado 3: cellule poligonali più grandi con un'ulteriore diminuzione del rapporto nucleo/citoplasma. Numero ridotto di cellule caliciformi, con colorazione ridotta. Grado 4: cellule basofile poligonali più grandi con nuclei picnotici. Cheratina intracellulare spesso dimostrabile. Cellule caliciformi assenti. Erano ottenibili solo pochi ciuffi sciolti. Anche la densità delle cellule caliciformi è classificata contando il numero medio di cellule per 100 cellule epiteliali in almeno quattro campi ad alta potenza (HPF). Grado 1: >30 cellule caliciformi/4 HPF. Grado 2: 15-30 cellule caliciformi/ 4 HPF. Grado 3: 5-15 cellule caliciformi/ 4 HPF. Grado 4: <5 cellule caliciformi/4 HPF.

L'imaging al microscopio confocale in vivo della cornea verrà eseguito prima dell'uso della lente ea 3 e 6 mesi dopo l'uso della lente da un esaminatore mascherato su tutti i soggetti presso la National Taiwan University. Una goccia di soluzione di proparacaina allo 0,5% e lacrime artificiali è stata instillata immediatamente prima di ogni esame. Dopo aver chiesto ai pazienti di guardare dritto davanti a loro, un microscopio confocale in vivo (Confoscan 3.4.1; Nidek Technologies, Padova, Italia) dotato di una lente frontale standard per immersione in acqua 40x, ha catturato automaticamente le immagini dell'intero spessore della cornea centrale. Ciascun esame ha richiesto da 1 a 3 minuti circa e ha registrato 350 immagini a una distanza di 1,5 e 4 μm sull'asse z tra immagini successive. Durante ogni visita, le misurazioni sono state ripetute con un intervallo z di 4 um per 3 volte seguito da un intervallo z di 1,5 um per 3 volte. Segue l'analisi della morfologia delle cellule epiteliali, dello spessore epiteliale e della reazione stromale che è stata pubblicata da Chen et al22-24. Verranno registrate e analizzate anche la morfologia e la densità del nervo corneale.

Le lenti a contatto usate saranno riposte nelle custodie fornite e riportate indietro per verificare la completezza della lente senza strappi o pezzi scheggiati. Le lenti vengono quindi utilizzate per ulteriori analisi del materiale mediante elettromicroscopia a scansione (SEM) e determinazione dell'adesione batterica con finanziamenti personali. Per SEM, le lenti usate sono state fissate in fissativo Karnovskys a metà forza (2% paraformaldeide e 2,5% glutaraldeide) dopo un lavaggio delicato. Il fissativo è stato rimosso ed è stata aggiunta acqua distillata per il risciacquo. Il congelamento rapido con immersione in azoto liquido è stato effettuato prima di essere posto sotto vuoto durante la notte. Il lato concavo dei campioni è stato montato su mozziconi di alluminio e rivestito con sputtering d'oro per l'esame al SEM (JEOL Ltd, JSM 5300, Giappone) a 15kV con vari ingrandimenti. Per la determinazione dell'adesione batterica, le lenti usate vengono raccolte in piastre sterili e immerse delicatamente tre volte in PBS prima del posizionamento in provette eppendorf contenenti 1 ml di PBS. Le lenti vengono quindi macerate e vengono eseguite diluizioni seriali fino a 105 prima della placcatura su agar Muller-Hinton. Le piastre di agar vengono incubate durante la notte e le unità formanti colonia vengono contate il giorno successivo. Il numero di colonie moltiplicato per il fattore di diluizione diviso per il volume placcato darà CFU/ml/per lente a contatto.

Tutti i dati verranno inseriti nel foglio di calcolo Excel (Microsoft, Inc) e analizzati utilizzando il software SPSS per Windows (11.0, SPSS, Inc.). Verranno utilizzati t-test appaiati per confrontare tutti i parametri prima e dopo l'uso delle lenti a contatto colorate colorate.