Vliv kosmetických barevných tónovaných kontaktních čoček na povrch oka

3. Metody Všechny subjekty jsou povinny vyplnit základní informace a vyplnit dotazník před a po nošení kontaktních čoček. Subjekty budou vyšetřeny a testovány před nasazením na barevně tónované kontaktní čočky s biomikroskopií se štěrbinovou lampou a barvením fluoresceinem (Heig Strait, Německo), měření nitroočního tlaku pomocí pneumotonometrie (Topcon® CT-80), refraktometru (Topcon® KR-8900) , nekorigovaná a nejlépe korigovaná Snellenova zraková ostrost (UCVA a BCVA), Schirmirův test 1, doba rozpadu slzného filmu (TBUT), topografie rohovky (Bausch & Lomb® Orb IIz) a měření hustoty endoteliálních buněk pomocí zrcadlové mikroskopie (Konan Noncon Robo-Sp-9000, USA). Vyšetření se provádí také po 1 týdnu, 1, 3 a 6 měsících nošení čoček. Během každé návštěvy se vyplňuje speciální tabulka pro všechny subjekty. Během každého vyšetření budou subjekty pozorovány na známky spojivkové injekce, spojivkové papilární hypertrofie, tvorby pannu a rohovkové epiteliopatie. Tyto znaky jsou odstupňované, jak je uvedeno v tabulce níže.

Příznaky 0=Normální 1=Mírné 2=Střední 3=Silné spojivkové injekce Žádné Minimální Zjevné Difuzní Velikost papil Žádné <0,25 mm 0,25-0,5 mm >0,5 mm povrchový pannus Žádný pannus 1 kvadrant 2 kvadranty >=3 kvadranty Tečkovaná epiteliopatie Žádná < 1/3 rohovky 1/3-1/2 rohovky Konfluentní nebo s defektem epitelu

Schirmirův test 1 (test bazální sekrece) se provádí po dobu 5 minut a považuje se za abnormální, pokud filtrační proužek navlhne na délku < 5 mm. TBUT kratší než 10 sekund je považováno za abnormální.

Otiskovací cytologie bude provedena před nošením čočky a 3 a 6 měsíců po nošení čočky na National Taiwan University. Nitrocelulózový filtrační papír o velikosti pórů 0,22 μm (Millipore GSWP 04700, Billerica, MA, U.S.A.) se nařeže na proužky (asi 4x8 mm). Po aplikaci kapky topického anestetika (proparakain 0,5 %) jsou přebytečné slzy jemně absorbovány sterilními vatovými tampony. Nitrocelulózový proužek se umístí na povrch limbální spojivky. Po mírném tlaku se papírové proužky sloupnou a ihned fixují v 95% lihu. Proužky jsou poté obarveny pomocí kyseliny jodové-Schiff (PAS; Sigma 395132, Hattiesburg, MS, USA) a zkoumány pod světelnou mikroskopií při 40x zvětšení a klasifikovány pozorovateli na maskách podle kritérií Saini et al.21 následovně. Stupeň 1: Malé kulaté epiteliální buňky s poměrem jádra k cytoplazmě 1:2. Přítomno velké množství hluboce pozitivních buněk. Obvykle se získá dobrý splývající list buněk. Stupeň 2: Dobrý buněčný list sestávající z větších polygonálních epiteliálních buněk se sníženým nukleocytoplazmatickým poměrem 1:3. Počet pohárkových buněk snížený, ale stále hluboce PAS-pozitivní. Stupeň 3: Větší polygonální buňky s dalším snížením poměru jádra k cytoplazmě. Snížený počet pohárkových buněk se sníženým barvením. Stupeň 4: Větší polygonální bazofilní buňky s pyknotickými jádry. Často prokazatelný intracelulární keratin. Nepřítomné pohárkové buňky. Bylo možné získat pouze několik volných shluků. Hustota pohárkových buněk je také hodnocena počítáním průměrného počtu buněk na 100 epiteliálních buněk v alespoň čtyřech vysoce výkonných polích (HPF). Stupeň 1: >30 pohárkových buněk/4 HPF. Stupeň 2: 15-30 pohárkových buněk/4 HPF. Stupeň 3: 5-15 pohárkových buněk/4 HPF. Stupeň 4: <5 pohárkových buněk/4 HPF.

Zobrazování rohovky in vivo konfokální mikroskopií bude provedeno před nošením čočky a 3 a 6 měsíců po nošení čočky jedním maskovaným zkoušejícím u všech subjektů na National Taiwan University. Jedna kapka 0,5% roztoku proparakainu a umělých slz byla vkapána bezprostředně před každým vyšetřením. Poté, co pacienty požádáte, aby se dívali přímo před sebe, in vivo konfokální mikroskop (Confoscan 3.4.1; Nidek Technologies, Padova, Itálie) vybavený standardní 40x přední čočkou ponořenou do vody automaticky snímal snímky celé tloušťky centrální rohovky. Každé vyšetření trvalo přibližně 1 až 3 minuty a zaznamenalo 350 snímků ve vzdálenosti 1,5 a 4 μm na ose z mezi po sobě jdoucími snímky. Během každé návštěvy byla měření opakována s 4 um z-intervalem 3krát a následně 1,5 um z-intervalem 3krát. Následuje analýza morfologie epiteliálních buněk, tloušťky epitelu a stromální reakce, kterou publikovali Chen et al22-24. Morfologie a hustota rohovkového nervu bude také zaznamenána a analyzována.

Použité kontaktní čočky budou uloženy do poskytnutých úložných pouzder a přineseny zpět ke kontrole úplnosti čočky bez natržení nebo odštípnutí. Čočky jsou pak použity pro další analýzu materiálu pomocí skenovací elektromikroskopie (SEM) a stanovení bakteriální adheze s osobním financováním. Pro SEM byly použité čočky po jemném omytí fixovány v polovičním Karnovského fixativu (2% paraformaldehyd a 2,5% glutaraldehyd). Fixační prostředek byl odstraněn a byla přidána destilovaná voda pro opláchnutí. Před umístěním do vakua přes noc bylo provedeno rychlé zmrazení ponořením do kapalného dusíku. Konkávní strana vzorků byla namontována na hliníkové nástavce a potažena rozprašováním zlatem pro zkoumání pod SEM (JEOL Ltd, JSM 5300, Japonsko) při 15 kV při různém zvětšení. Pro stanovení bakteriální adheze se použité čočky shromáždí do sterilních destiček a jemně se třikrát ponoří do PBS před umístěním do eppendorfových zkumavek obsahujících 1 ml PBS. Čočky se poté macerují a provedou se sériová ředění až do 105 před nanesením na Muller-Hinton agar. Agarové plotny se inkubují přes noc a jednotky tvořící kolonie se spočítají následující den. Počet kolonií vynásobený faktorem ředění vydělený objemem naneseným na plotnu poskytne CFU/ml/na kontaktní čočku.

Všechna data budou vložena do tabulky Excel (Microsoft, Inc.) a analyzována pomocí softwaru SPSS pro Windows (11.0, SPSS, Inc.). K porovnání všech parametrů před a po nošení barevně tónovaných kontaktních čoček budou použity párové t-testy.