De rol van de immuniteit van de gastheer bij het niet reageren op therapie met directe antivirale middelen (DAA).

Studiedoelstelling en hypothese De onderliggende hypothese van het project is dat de mate van antivirale immuundisfunctie bij chronische HCV-infectie een oorzakelijke factor is die de non-respons op therapie kan beïnvloeden. Er is echter geen informatie beschikbaar over de kenmerken van individuele antivirale T-celresponsen uitgedrukt door naïeve chronische HCV-patiënten voordat DAA-therapie werd gestart in relatie tot het daaropvolgende resultaat van de behandeling en hun mogelijke invloed op het niet onder controle krijgen van de infectie. De weinige beschikbare resultaten over anti-HCV-immuunresponsen bij chronische HCV-infectie zijn gegenereerd bij patiënten die werden behandeld met DAA-regimes die niet in deze richtlijnen zijn opgenomen zonder evaluatie op basis van de uitkomst. Het doel van de huidige studie zal dus zijn om te begrijpen of non-respons op therapie geassocieerd is met een bredere en diepere antivirale immuundisfunctie, door individuele HCV-specifieke T-celresponsen te vergelijken in twee groepen van responder en non-responder patiënten. De veronderstelling die wordt gemaakt is dat mogelijke defecten van T-celresponsen die verband houden met het niet reageren op DAA-therapie, niet substantieel mogen worden gewijzigd door een ineffectieve behandeling die het mogelijk maakt de immunologische achtergrond van patiënten die niet reageren te karakteriseren na het einde van een ineffectieve therapiecyclus en om vergelijk de resultaten met de reacties op de uitgangssituatie vóór de behandeling van naïeve, viremische patiënten die vervolgens het virus verwijderen. Een analyse voorafgaand aan de behandeling, ook voor patiënten die niet reageren, zou een groot aantal naïeve patiënten moeten inschrijven om een ​​voldoende aantal patiënten die niet reageren te identificeren, wat de studie onhaalbaar en buitengewoon lang zou maken. Door deze strategie zal de werving in plaats daarvan zeer snel verlopen, omdat wordt verwacht dat de meeste patiënten die bij aanvang zijn ingeschreven, responder zullen zijn, terwijl niet-responderende patiënten die na het einde van de therapie en na een adequate wash-outperiode van 6 tot 12 maanden en daarvoor zullen worden onderzocht beginnende herbehandeling zijn al geïdentificeerd in de samenwerkende centra en zullen direct beschikbaar zijn voor de studie zodra het protocol is goedgekeurd. Op basis van de resultaten zou het mogelijke doel van toekomstige analyses kunnen zijn om op moleculair niveau de T-cel functionele defecten van non-responder patiënten verder te karakteriseren om te bepalen of en met welke strategieën hun correctie een haalbare benadering kan zijn om een ​​efficiënte anti -virale respons om het effect van DAA van de laatste generatie aan te vullen en te versterken. Ten slotte zou de karakterisering van beschermende immuniteit bij non-responderpatiënten het mogelijk kunnen maken om baseline-voorspellers van non-respons op therapie te identificeren die in de dagelijkse klinische praktijk kunnen worden gebruikt.

Studieachtergrond Het percentage aanhoudende virale respons (SVR) bij naïeve niet-cirrotische patiënten die worden behandeld met IFN-vrije DAA's ligt tussen 95% en 100%, maar het responspercentage is lager in specifieke subgroepen van patiënten, waaronder genotype 3 cirrotica en patiënten met gedecompenseerde cirrose, ongeacht het infecterende genotype. De hoge werkzaamheid van op DAA gebaseerde therapieën wordt bevestigd in real-world cohorten, die een SVR-percentage laten zien dat slechts iets lager is dan in registratiestudies. Hoewel de mate van falen van DAA-therapie vrij beperkt is (ongeveer 5%), wordt verwacht dat het totale aantal patiënten dat niet reageert hoog zal zijn vanwege het grote aantal chronisch met HCV geïnfecteerde patiënten die behandeling nodig hebben. Falen van de behandeling resulteert meestal in terugval en minder vaak in virale doorbraak tijdens de behandeling. Aangenomen wordt dat verschillende factoren betrokken zijn bij het niet reageren op therapie, waaronder het optreden van resistentiemutaties, suboptimale behandeling als gevolg van onjuiste genotypedefinitie en gevorderde leverziekte.

De rol van baseline-RAV's bij het bepalen van het falen van de behandeling wordt nog steeds besproken en baseline-resistentietesten lijken een beperkt klinisch nut te hebben. In plaats daarvan is de opkomst van RAV's tijdens op DAA gebaseerde regimes en de rol ervan bij het bepalen van virologisch falen goed gedocumenteerd. Zelfs als geneesmiddelresistente varianten worden gedetecteerd bij een groot deel van de patiënten die niet reageren, is hun rol bij het verminderen van de effectiviteit van de behandeling echter niet helemaal duidelijk.

Het gebruik van momenteel beschikbare commerciële tests van de tweede generatie voor HCV-genotypering heeft het risico op misclassificatie van het genotype verminderd, maar de mogelijkheid van gemengde infecties met een percentage van verschillende genotypen/subtypen dat onder de gevoeligheid ligt van de methoden die in de klinische praktijk worden toegepast, is nog steeds mogelijk oorzaak van niet reageren op therapie vanwege suboptimale behandeling.

De opkomst van resistente stammen en suboptimale behandeling als gevolg van onjuiste genotypedetectie kunnen echter slechts een deel van de gevallen van falende behandeling verklaren en gastheergerelateerde factoren kunnen een rol spelen, met name de antivirale immuunrespons. Het is inderdaad bekend dat aangeboren en adaptieve immuunresponsen ernstig aangetast zijn bij chronische HCV-infectie, maar er is zeer beperkte informatie beschikbaar over de mogelijke bijdrage die achtergrondimmuunresponsen kunnen leveren aan het uiteindelijke resultaat van DAA-behandeling. In tegenstelling tot op PegIFN gebaseerde therapieën, geven recente onderzoeken bij met DAA behandelde patiënten aan dat de frequentie en functie van HCV-specifieke CD8-cellen kan toenemen onder IFN-vrije therapieën met gedeeltelijke omkering van hun uitgeputte fenotype. Bovendien kan DAA-therapie het NK-celcompartiment moduleren, waardoor het door NK-cellen geactiveerde fenotype wordt gecorrigeerd, wat typerend is voor chronische HCV-patiënten. Het niveau van baseline-aantasting van antivirale immuniteit kan dus de daaropvolgende waarschijnlijkheid van immuunherstel na therapie beïnvloeden met meer kansen op resistentie tegen DAA-behandeling wanneer baseline immuunremming dieper en breder is. Deze hypothese moet getest worden.

Primaire eindpunten Het doel van de studie is het vergelijken van de intensiteit (totale niveaus van antivirale functies) en kwaliteit (multispecificiteit en multifunctionaliteit) van de totale HCV-specifieke T-celrespons bij patiënten die niet reageren (met en zonder detecteerbare resistentie-geassocieerde varianten - RAV's) en responder op DAA-therapie. Om dit doel te bereiken, zullen CD4- en CD8-gemedieerde responsen worden beoordeeld door gebruik te maken van overlappende synthetische peptiden die het algehele HCV-proteoom van genotype 1 bedekken om de T-celreactiviteit op alle HCV-eiwitten te karakteriseren, in termen van cytokineproductie (IL2, IFN- g en TNF-a) en cytotoxisch potentieel (CD107-degranulatie).

• Als primair eindpunt zal de algehele intensiteit van T-celresponsen worden beoordeeld bij patiënten die wel en niet reageren; de totale intensiteit van individuele T-celreactiviteit zal worden gedefinieerd door de verschillende geanalyseerde T-celparameters (cytokineproductie en cytotoxiciteit, zoals gedetecteerd in het totale aantal CD3-cellen en CD4/CD8-subsets) op te tellen voor elke individuele responder en non-responderpatiënt; de resulterende waarden zullen vervolgens worden vergeleken in de twee groepen patiënten.
• Op een tweede analyseniveau zullen kwalitatieve verschillen in T-celreactiviteit tussen responder- en non-responderpatiënten worden beoordeeld in termen van multifunctionaliteit en multi-specificiteit van HCV-specifieke T-celresponsen, door de expressie van elke individuele functie afzonderlijk te vergelijken (IL2, IFN-g, TNF-a) en het vermogen van elk individueel HCV-eiwit om T-celresponsen te induceren in de twee groepen patiënten.

Karakterisering van HCV-specifieke T-celreacties.

1. Om de globale CD4+- en CD8+-reactiviteit tegen structurele en niet-structurele HCV-eiwitten te analyseren, zal een uitgebreid panel van overlappende 15-meer peptiden die de volledige HCV-sequentie (genotype 1) bestrijken, worden gebruikt; T-celresponsen zullen worden geanalyseerd door flow-cytometrische intracellulaire cytokinekleuring (ICS) voor IFN-g, IL-2 en TNF-a en voor degranulatie (up-regulatie van CD107) in vitro (na 10 dagen peptidestimulatie) en door Elispot voor IFN-g ex-vivo (na kortdurende peptidestimulatie); synthetische peptide-epitopen met HLA klasse I- en klasse II-beperkte specificiteiten en waarvan bekend is dat ze de doelwitten zijn van CD8+- en CD4+-responsen tegen verschillende HCV-niet-verwante virussen en pathogenen (CMV, EBV, FLU) zullen als controles worden gebruikt.
2. Om de reactiviteit van CD8+-T-cellen verder te analyseren, zullen HLA-A2/peptide-dextrameren die enkele van de meest algemeen erkende HLA-A2-beperkte epitopen van HCV bevatten, worden gebruikt bij HLA-A2+-patiënten om circulerende virusspecifieke CD8+-cellen te kwantificeren en om de expansiecapaciteit te meten door het vergelijken van dextrameer-positieve CD8 + celfrequenties ex-vivo en na 10 dagen peptidestimulatie.
3. Bij patiënten die niet reageren en resistentiemutaties vertonen, zullen specifieke peptiden die overeenkomen met de variante sequenties worden gesynthetiseerd en gebruikt om te analyseren of opkomende mutaties HCV-specifieke T-celactivering en -functie kunnen beïnvloeden. Hiertoe zal het stimulerende effect op verschillende T-celfuncties van prototype- en variantpeptiden (cytokineproductie, cytotoxiciteit, expansievermogen) worden vergeleken

Secundaire eindpunten

1. Analyse van aanvullende immuunpopulaties en serumfactoren waarvan bekend is dat ze relevant zijn met betrekking tot de controle van virusinfectie en modulatie van T-celresponsen.

   • Natural Killer (NK)-celanalyse: het fenotype van NK-cellen zal bestudeerd worden door de expressie van specifieke markers, zoals CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR te bepalen door middel van flowcytometrie; De functie van NK-cellen zal worden bestudeerd door IFN-g/TNF-a-productie en CD107-degranulatie te testen na een nachtelijke PBMC-incubatie met geschikte stimuli.
   • Analyse van T-regulerende cellen (Treg): frequentie, fenotype en functie zullen bestudeerd worden op volledige PBMC's die samen gekleurd zijn met CD3, CD4, CD25, FoxP3 en CD45RA.
   • De serumconcentratie van cytokines, chemokines en ISG, inclusief IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g en IL28, zal worden geanalyseerd in de sera van patiënten met behulp van de Luminex-technologie.
2. Identificatie van baseline-voorspellers van non-respons op DAA-therapie Opheldering van de impact die de antivirale immuunrespons kan hebben bij non-respons op therapieën met of zonder proteaseremmers