Rolle der Wirtsimmunität bei der Nicht-Reaktion auf die Therapie mit direkten antiviralen Mitteln (DAA).

Studienziel und Hypothese Die dem Projekt zugrunde liegende Hypothese ist, dass das Ausmaß der antiviralen Immundysfunktion bei einer chronischen HCV-Infektion ein kausaler Faktor ist, der das Nichtansprechen auf die Therapie beeinflussen kann. Es sind jedoch keine Informationen über die Merkmale individueller antiviraler T-Zell-Antworten, die von naiven chronischen HCV-Patienten vor Beginn der DAA-Therapie in Bezug auf das spätere Behandlungsergebnis und ihre mögliche Auswirkung auf das Versagen der Infektionskontrolle exprimiert werden, verfügbar. Die wenigen verfügbaren Ergebnisse zu Anti-HCV-Immunantworten bei chronischer HCV-Infektion wurden bei Patienten generiert, die mit DAA-Schemata behandelt wurden, die nicht in die vorliegenden Leitlinien ohne Bewertung gemäß dem Ergebnis aufgenommen wurden. Ziel der vorliegenden Studie ist es daher zu verstehen, ob das Nichtansprechen auf die Therapie mit einer breiteren und tieferen antiviralen Immundysfunktion verbunden ist, indem individuelle HCV-spezifische T-Zell-Antworten in zwei Gruppen von Responder- und Non-Responder-Patienten verglichen werden. Es wird davon ausgegangen, dass mögliche Defekte der T-Zell-Antworten, die mit dem Nichtansprechen auf eine DAA-Therapie verbunden sind, durch eine unwirksame Behandlung nicht wesentlich modifiziert werden sollten, um den immunologischen Hintergrund von Non-Responder-Patienten nach dem Ende eines unwirksamen Therapiezyklus zu charakterisieren und zu charakterisieren Vergleichen Sie die Ergebnisse mit den Ausgangsreaktionen vor der Behandlung von naiven, virämischen Patienten, die anschließend das Virus beseitigen. Eine Vorbehandlungsanalyse auch für Non-Responder-Patienten würde die Aufnahme einer großen Anzahl von naiven Patienten erfordern, um eine ausreichende Anzahl von Non-Responder-Patienten zu identifizieren, was die Studie undurchführbar und übermäßig lang macht. Durch diese Strategie wird die Rekrutierung stattdessen sehr schnell erfolgen, da erwartet wird, dass die meisten Patienten, die zu Beginn der Studie aufgenommen wurden, Responder sind, während Non-Responder-Patienten nach dem Ende der Therapie und nach einer angemessenen Auswaschphase von 6 bis 12 Monaten und davor untersucht werden Beginn der erneuten Behandlung wurden bereits in den kooperierenden Zentren identifiziert und stehen für die Studie zur Verfügung, sobald das Protokoll genehmigt ist. Basierend auf den Ergebnissen könnte ein mögliches Ziel zukünftiger Analysen darin bestehen, die T-Zell-Funktionsdefekte von Non-Responder-Patienten auf molekularer Ebene weiter zu charakterisieren, um zu definieren, ob und durch welche Strategien ihre Korrektur einen praktikablen Ansatz zur Induktion/Wiederherstellung eines effizienten Anti darstellen kann -virale Reaktion, um die Wirkung von DAA der letzten Generation zu ergänzen und zu verstärken. Schließlich könnte die Charakterisierung der schützenden Immunität bei Non-Responder-Patienten es ermöglichen, Baseline-Prädiktoren für das Nichtansprechen auf die Therapie zu identifizieren, die in der täglichen klinischen Praxis verwendet werden können.

Hintergrund der Studie Die Rate der anhaltenden viralen Reaktion (SVR) bei naiven Patienten ohne Zirrhose, die mit IFN-freien DAAs behandelt wurden, liegt zwischen 95 % und 100 %, aber die Ansprechrate ist in bestimmten Untergruppen von Patienten niedriger, einschließlich Genotyp-3-Zirrhotiker und Patienten mit dekompensierte Zirrhose, unabhängig vom infizierenden Genotyp. Die hohe Wirksamkeit von DAA-basierten Therapien wird in realen Kohorten bestätigt, die eine SVR-Rate zeigen, die nur geringfügig niedriger ist als in Zulassungsstudien. Obwohl die Rate des Versagens der DAA-Therapie ziemlich begrenzt ist (etwa 5 %), wird erwartet, dass die Gesamtzahl der Non-Responder-Patienten aufgrund der großen Zahl chronisch HCV-infizierter Patienten, die eine Behandlung benötigen, hoch sein wird. Ein Behandlungsversagen führt am häufigsten zu einem Rückfall und seltener zu einem viralen Durchbruch während der Behandlung. Es wird angenommen, dass verschiedene Faktoren am Nichtansprechen auf die Therapie beteiligt sind, darunter das Auftreten von Resistenzmutationen, eine suboptimale Behandlung aufgrund einer falschen Genotypdefinition und eine fortgeschrittene Lebererkrankung.

Die Rolle von Baseline-RAVs bei der Feststellung eines Therapieversagens wird noch diskutiert, und Baseline-Resistenztests scheinen einen begrenzten klinischen Nutzen zu haben. Stattdessen ist das Auftreten von RAVs während DAA-basierter Therapien und ihre Rolle bei der Bestimmung des virologischen Versagens gut dokumentiert. Auch wenn arzneimittelresistente Varianten bei einem großen Teil der Non-Responder-Patienten nachgewiesen werden, ist ihre Rolle bei der Beeinträchtigung der Behandlungswirksamkeit jedoch nicht vollständig klar.

Die Verwendung von derzeit verfügbaren kommerziellen Assays der zweiten Generation für die HCV-Genotypisierung hat das Risiko einer Genotyp-Fehlklassifizierung verringert, aber die Möglichkeit von Mischinfektionen mit einem Prozentsatz verschiedener Genotypen/Subtypen unterhalb der Empfindlichkeit der in der klinischen Praxis angewandten Methoden ist immer noch möglich Ursache des Nichtansprechens auf die Therapie aufgrund einer suboptimalen Behandlung.

Das Auftreten resistenter Stämme und eine suboptimale Behandlung aufgrund eines falschen Genotypnachweises können jedoch nur einen Teil der Fälle von Behandlungsversagen erklären, und wirtsbezogene Faktoren können eine Rolle spielen, insbesondere die antivirale Immunantwort. In der Tat ist bekannt, dass angeborene und adaptive Immunantworten bei einer chronischen HCV-Infektion stark beeinträchtigt sind, aber es sind nur sehr begrenzte Informationen über den möglichen Beitrag verfügbar, den Hintergrund-Immunantworten zum Endergebnis der DAA-Behandlung leisten können. Im Gegensatz zu PegIFN-basierten Therapien weisen neuere Studien an mit DAA behandelten Patienten darauf hin, dass die Häufigkeit und Funktion von HCV-spezifischen CD8-Zellen unter IFN-freien Therapien mit teilweiser Umkehrung ihres erschöpften Phänotyps zunehmen kann. Darüber hinaus kann die DAA-Therapie das NK-Zell-Kompartiment modulieren, wodurch der NK-Zell-aktivierte Phänotyp korrigiert wird, der für chronische HCV-Patienten typisch ist. Daher könnte das Ausmaß der Beeinträchtigung der antiviralen Immunität zu Beginn die nachfolgende Wahrscheinlichkeit einer Wiederherstellung des Immunsystems nach der Therapie beeinflussen, wobei die Wahrscheinlichkeit einer Resistenz gegen die DAA-Behandlung größer ist, wenn die Immunhemmung zu Beginn der Studie tiefer und breiter ist. Diese Hypothese muss überprüft werden.

Primäre Endpunkte Ziel der Studie ist der Vergleich der Intensität (Gesamtniveau der antiviralen Funktionen) und Qualität (Multispezifität und Multifunktionalität) der gesamten HCV-spezifischen T-Zell-Antwort bei Non-Responder-Patienten (mit und ohne nachweisbar). resistenzassoziierte Varianten – RAVs) und Responder auf die DAA-Therapie. Um dieses Ziel zu erreichen, werden CD4- und CD8-vermittelte Reaktionen bewertet, indem überlappende synthetische Peptide verwendet werden, die das gesamte HCV-Proteom des Genotyps 1 abdecken, um die T-Zell-Reaktivität gegenüber allen HCV-Proteinen in Bezug auf die Zytokinproduktion (IL2, IFN- g und TNF-a) und zytotoxisches Potential (CD107-Degranulation).

• Als primärer Endpunkt wird die Gesamtintensität der T-Zell-Antworten bei Responder- und Non-Responder-Patienten bewertet; die Gesamtintensität der individuellen T-Zell-Reaktivität wird durch Summieren der verschiedenen analysierten T-Zell-Parameter (Zytokinproduktion und Zytotoxizität, wie in Gesamt-CD3-Zellen und CD4/CD8-Untergruppen nachgewiesen) für jeden einzelnen Responder- und Non-Responder-Patienten definiert; die resultierenden Werte werden dann in den beiden Patientengruppen verglichen.
• Auf einer zweiten Analyseebene werden qualitative Unterschiede in der T-Zell-Reaktivität zwischen Responder- und Non-Responder-Patienten im Hinblick auf Multifunktionalität und Multispezifität von HCV-spezifischen T-Zell-Antworten bewertet, indem die Expression jeder einzelnen Funktion separat verglichen wird (IL2, IFN-g, TNF-a) und die Fähigkeit jedes einzelnen HCV-Proteins, T-Zell-Antworten in den beiden Patientengruppen zu induzieren.

Charakterisierung von HCV-spezifischen T-Zellantworten.

1. Um die globale CD4+- und CD8+-Reaktivität gegen strukturelle und nicht-strukturelle HCV-Proteine ​​zu analysieren, wird ein umfassendes Panel überlappender 15-mer-Peptide verwendet, die die gesamte HCV-Sequenz (Genotyp 1) abdecken; T-Zellantworten werden durch durchflusszytometrische intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) auf IFN-g, IL-2 und TNF-a und auf Degranulation (Hochregulierung von CD107) in vitro (nach 10 Tagen Peptidstimulation) und durch analysiert Elispot für IFN-g ex-vivo (nach kurzzeitiger Peptidstimulation); synthetische Peptidepitope mit HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-eingeschränkten Spezifitäten, die bekanntermaßen die Ziele von CD8+- und CD4+-Antworten gegen verschiedene HCV-unabhängige Viren und Pathogene (CMV, EBV, FLU) sind, werden als Kontrollen verwendet.
2. Zur weiteren Analyse der CD8+-T-Zell-Reaktivität werden HLA-A2/Peptid-Dextramere, die einige der bekanntesten HLA-A2-beschränkten Epitope von HCV enthalten, bei HLA-A2+-Patienten verwendet, um zirkulierende virusspezifische CD8+-Zellen zu quantifizieren und die Expansionskapazität zu messen durch Vergleich der Dextramer-positiven CD8+-Zellfrequenzen ex-vivo und nach 10 Tagen Peptidstimulation.
3. Bei Non-Responder-Patienten, die das Auftreten von Resistenzmutationen zeigen, werden spezifische Peptide, die den Variantensequenzen entsprechen, synthetisiert und verwendet, um zu analysieren, ob neu auftretende Mutationen die HCV-spezifische T-Zell-Aktivierung und -Funktion beeinflussen können. Dazu wird die stimulierende Wirkung auf verschiedene T-Zellfunktionen von Prototyp- und Variantenpeptiden (Zytokinproduktion, Zytotoxizität, Expansionsfähigkeit) verglichen

Sekundäre Endpunkte

1. Analyse zusätzlicher Immunpopulationen und Serumfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie im Hinblick auf die Kontrolle einer Virusinfektion und die Modulation von T-Zell-Antworten relevant sind.

   • Analyse natürlicher Killerzellen (NK): Der Phänotyp von NK-Zellen wird untersucht, indem die Expression spezifischer Marker wie CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR durch Durchflusszytometrie bewertet wird; Die NK-Zellfunktion wird untersucht, indem die IFN-g/TNF-a-Produktion und die CD107-Degranulation nach PBMC-Inkubation über Nacht mit geeigneten Stimuli getestet werden.
   • Analyse von regulatorischen T-Zellen (Treg): Häufigkeit, Phänotyp und Funktion werden an ganzen PBMCs untersucht, die mit CD3, CD4, CD25, FoxP3 und CD45RA co-gefärbt sind.
   • Die Serumkonzentration von Zytokinen, Chemokinen und ISG, einschließlich IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g und IL28, wird in Patientenseren mit der Luminex-Technologie analysiert.
2. Identifizierung von Baseline-Prädiktoren des Nichtansprechens auf die DAA-Therapie Aufklärung der Auswirkungen, die die antivirale Immunantwort beim Nichtansprechen auf Therapien mit oder ohne Protease-Inhibitoren haben kann