A gazdaimmunitás szerepe a közvetlen vírusellenes szer (DAA) terápiára adott válasz hiányában

A vizsgálat célja és hipotézise A projekt hipotézise az, hogy a krónikus HCV-fertőzésben az antivirális immunrendszer diszfunkció szintje olyan ok-okozati tényező, amely befolyásolhatja a terápiára adott válasz hiányát. Azonban nem állnak rendelkezésre információk a naiv krónikus HCV-betegek által a DAA-terápia megkezdése előtt kifejezett egyéni vírusellenes T-sejtes válaszok jellemzőiről, a kezelés későbbi kimenetelével és a fertőzés kontrollálásának sikertelenségére gyakorolt ​​lehetséges hatásával kapcsolatban. A krónikus HCV-fertőzésben az anti-HCV immunválaszokkal kapcsolatban rendelkezésre álló kevés eredményt olyan DAA-sémákkal kezelt betegeknél hozták létre, amelyek nem szerepelnek a jelen irányelvekben az eredmény szerinti értékelés nélkül. A jelen tanulmány célja tehát annak megértése, hogy a terápiára való nem reagálás összefüggésben áll-e egy szélesebb és mélyebb vírusellenes immunrendszeri zavarral, összehasonlítva az egyéni HCV-specifikus T-sejt-válaszokat két csoportban, a reagáló és a nem reagáló betegekben. Feltételezzük, hogy a DAA-terápiára nem reagáló T-sejt-válasz lehetséges hibáit nem szabad lényegesen módosítani egy nem hatékony kezeléssel, amely lehetővé teszi a nem reagáló betegek immunológiai hátterének jellemzését a hatástalan kezelési ciklus befejezése után, és hasonlítsa össze az eredményeket a naiv, virémiás betegek kiindulási kezelés előtti válaszaival, akik ezt követően eltávolították a vírust. A kezelés előtti elemzéshez a nem reagáló betegek esetében is nagyszámú naiv beteg bevonására lenne szükség ahhoz, hogy elegendő számú nem reagáló beteget azonosítsanak, így a vizsgálat kivitelezhetetlenné és rendkívül hosszú ideig tartana. Ezzel a stratégiával a toborzás ehelyett nagyon gyors lesz, mivel a kiinduláskor felvett betegek többsége várhatóan reagálni fog, míg a nem reagáló betegek, akiket a terápia befejezése után és egy megfelelő, 6-12 hónapos kimosódási időszak után és azelőtt vizsgálnak meg. Az újbóli kezelés megkezdését már azonosították az együttműködő központokban, és azonnal elérhetőek lesznek a vizsgálathoz, amint a protokollt jóváhagyják. Az eredmények alapján a jövőbeli elemzések lehetséges célja az lehet, hogy molekuláris szinten tovább jellemezzék a nem reagáló betegek T-sejt funkcionális hibáit, hogy meghatározzák, vajon ezek korrekciója megvalósítható-e, és milyen stratégiákkal jelentheti-e a hatékony anti-indukálást/helyreállítást. -vírusválasz kiegészíti és erősíti az utolsó generációs DAA hatását. Végül, a nem reagáló betegek protektív immunitásának jellemzése lehetővé teheti a terápiára nem reagáló kiindulási előrejelzők azonosítását a napi klinikai gyakorlatban.

A vizsgálat háttere A tartós vírusválasz (SVR) aránya IFN-mentes DAA-val kezelt, naiv, nem cirrhotikus betegeknél 95% és 100% között van, de a válaszarány alacsonyabb a betegek bizonyos alcsoportjaiban, beleértve a 3-as genotípusú májzsugorodást és a cirrhoticus betegeket. dekompenzált cirrhosis, függetlenül a fertőző genotípustól. A DAA-alapú terápiák nagy hatékonyságát a valós kohorszok igazolják, amelyek az SVR arányát csak valamivel alacsonyabbak, mint a regisztrációs vizsgálatok. Bár a DAA-terápia sikertelenségének aránya meglehetősen korlátozott (körülbelül 5%), a nem reagáló betegek teljes száma várhatóan magas lesz, mivel nagy számban vannak kezelésre szoruló krónikus HCV-fertőzött betegek. A kezelés sikertelensége leggyakrabban relapszushoz, ritkábban pedig vírusáttöréshez vezet a kezelés során. Úgy gondolják, hogy a terápiára adott válasz hiányában különböző tényezők játszanak szerepet, ideértve a rezisztenciamutációk megjelenését, a helytelen genotípus-meghatározás miatti szuboptimális kezelést és az előrehaladott májbetegséget.

A kiindulási RAV-k szerepe a kezelés sikertelenségének meghatározásában még mindig vitatott, és úgy tűnik, hogy a kiindulási rezisztencia-teszt klinikai hasznossága korlátozott. Ehelyett jól dokumentált a RAV-ok megjelenése a DAA-alapú kezelések során, és szerepe a virológiai kudarc meghatározásában. Még ha a nem reagáló betegek nagy részében kimutatnak is gyógyszerrezisztens variánsokat, ezek szerepe a kezelés hatékonyságát rontó szerepükben azonban nem teljesen egyértelmű.

A jelenleg rendelkezésre álló második generációs kereskedelmi tesztek alkalmazása a HCV genotipizálására csökkentette a genotípus téves besorolásának kockázatát, de továbbra is lehetséges a vegyes fertőzések lehetősége, ahol a különböző genotípusok/altípusok százaléka a klinikai gyakorlatban alkalmazott módszerek érzékenysége alatt van. a szuboptimális kezelés miatti terápiára való reagálás hiányának oka.

A rezisztens törzsek megjelenése és a nem megfelelő genotípus-detektálás miatti szuboptimális kezelés azonban a kezelés sikertelenségének csak egy részét magyarázhatja, és a gazdaszervezettel kapcsolatos tényezők is szerepet játszhatnak, különösen a vírusellenes immunválasz. Valójában ismert, hogy a veleszületett és adaptív immunválaszok súlyosan károsodnak krónikus HCV-fertőzésben, de nagyon korlátozott információ áll rendelkezésre arról, hogy a háttér immunválaszok milyen mértékben járulhatnak hozzá a DAA-kezelés végső kimeneteléhez. A PegIFN-alapú terápiákkal ellentétben a DAA-val kezelt betegeken végzett közelmúltbeli vizsgálatok azt mutatják, hogy a HCV-specifikus CD8 sejtek gyakorisága és funkciója növekedhet IFN-mentes terápiák mellett, a kimerült fenotípus részleges megfordításával. Ezen túlmenően, a DAA terápia módosíthatja az NK sejt kompartmentet, korrigálja az NK sejt aktivált fenotípust, ami a krónikus HCV betegekre jellemző. Így a vírusellenes immunitás kiindulási károsodásának szintje befolyásolhatja az immunrendszer helyreállításának későbbi valószínűségét a terápia során, és nagyobb esélye van a DAA-kezeléssel szembeni rezisztenciára, amikor az alapszintű immungátlás mélyebb és szélesebb. Ezt a hipotézist ellenőrizni kell.

Elsődleges végpontok A vizsgálat célja a teljes HCV-specifikus T-sejtes válasz intenzitásának (az antivirális funkciók teljes szintje) és minőségének (multispecificitás és multifunkcionalitás) összehasonlítása olyan betegeknél, akik nem reagálnak (kimutatható vagy anélkül). rezisztenciával kapcsolatos variánsok – RAV-k) és a DAA-terápiára reagáló. E cél elérése érdekében a CD4 és CD8 által közvetített válaszokat az 1-es genotípus teljes HCV-proteomját lefedő, átfedő szintetikus peptidek segítségével értékeljük, hogy jellemezzük a T-sejtek reaktivitását az összes HCV-fehérjére, a citokintermelés szempontjából (IL2, IFN-). g és TNF-a) és citotoxikus potenciál (CD107 degranuláció).

• Elsődleges végpontként a T-sejtes válaszok általános intenzitását értékelik reagáló és nem reagáló betegeknél; az egyedi T-sejt-reaktivitás teljes intenzitását a különböző elemzett T-sejt-paraméterek (citokintermelés és citotoxicitás, a teljes CD3-sejtekben és a CD4/CD8-alcsoportokban kimutatott) összegzésével határozzák meg minden egyes reagáló és nem reagáló beteg esetében; a kapott értékeket ezután összehasonlítjuk a két betegcsoportban.
• Az elemzés második szintjén a válaszadó és nem reagáló betegek T-sejt-reaktivitásában mutatkozó kvalitatív különbségeket a HCV-specifikus T-sejtes válaszok multifunkcionalitása és multispecificitása szempontjából értékelik úgy, hogy az egyes funkciók expresszióját külön-külön összehasonlítják. (IL2, IFN-g, TNF-a) és az egyes HCV-fehérjék azon képessége, hogy T-sejt-választ indukáljanak a két betegcsoportban.

A HCV-specifikus T-sejtes válaszok jellemzése.

1. A strukturális és nem strukturális HCV fehérjékkel szembeni globális CD4+ és CD8+ reaktivitás elemzéséhez a teljes HCV (1. genotípus) szekvenciát lefedő, átfedő 15 tagú peptidekből álló átfogó panelt használunk; A T-sejt-válaszokat áramlási citometriás intracelluláris citokinfestéssel (ICS) elemzik az IFN-g, IL-2 és TNF-a, valamint a degranuláció (a CD107 fokozódása) szempontjából in vitro (10 napos peptidstimuláció után), valamint Elispot IFN-g ex-vivo (rövid távú peptid stimuláció után); Kontrollként olyan szintetikus peptidepitópokat használnak, amelyek HLA I. és II. osztályú korlátozott specificitásúak, és amelyekről ismert, hogy a CD8+ és CD4+ válaszok célpontjai különböző HCV-vel nem rokon vírusok és kórokozók (CMV, EBV, FLU) ellen.
2. A CD8+ T-sejt-reaktivitás további elemzésére a HCV legszélesebb körben elismert HLA-A2-korlátozott epitópjait tartalmazó HLA-A2/peptid dextramereket használnak majd HLA-A2+ betegekben a keringő vírusspecifikus CD8+ sejtek mennyiségi meghatározására és az expanziós kapacitás mérésére. a dextramer-pozitív CD8+ sejtek gyakoriságának összehasonlítása ex vivo és 10 napos peptidstimuláció után.
3. Azoknál a nem reagáló betegeknél, akiknél rezisztenciamutációt mutatnak ki, a variáns szekvenciáknak megfelelő specifikus peptideket szintetizálják, és felhasználják annak elemzésére, hogy a kialakuló mutációk befolyásolhatják-e a HCV-specifikus T-sejt aktivációt és működését. Ebből a célból a prototípus és variáns peptidek különböző T-sejt funkcióira (citokintermelés, citotoxicitás, expanziós képesség) kifejtett stimuláló hatást hasonlítjuk össze.

Másodlagos végpontok

1. További immunpopulációk és szérumfaktorok elemzése, amelyekről ismert, hogy relevánsak a vírusfertőzés szabályozása és a T-sejtes válaszok modulálása szempontjából.

   • Natural Killer (NK) sejtelemzés: Az NK sejt fenotípusát specifikus markerek, például CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR expressziójának áramlási citometriával történő értékelésével vizsgáljuk; Az NK-sejtek működését az IFN-g/TNF-a termelés és a CD107 degranuláció tesztelésével vizsgáljuk egy éjszakán át tartó PBMC megfelelő ingerekkel végzett inkubáció után.
   • A T szabályozó sejt (Treg) analízise: a gyakoriságot, a fenotípust és a funkciót CD3, CD4, CD25, FoxP3 és CD45RA-val együtt festett teljes PBMC-ken tanulmányozzuk.
   • A citokinek, kemokinek és ISG, köztük az IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g és IL28 szérumkoncentrációját a Luminex technológia segítségével elemzik a betegek szérumában.
2. A DAA-terápiára adott válasz hiányának kiindulási előrejelzőinek azonosítása Annak a hatásnak a tisztázása, amelyet a vírusellenes immunválasz okozhat, ha nem reagál a proteázgátlókkal vagy anélkül végzett terápiákra