Värdimmunitetens roll i icke-svar på direkt antiviralt medel (DAA) terapi

Studiemål och hypotes Den underliggande hypotesen för projektet är att nivån av antiviral immundysfunktion vid kronisk HCV-infektion är en orsaksfaktor som kan påverka utebliven behandling. Information om egenskaperna hos individuella antivirala T-cellsvar som uttrycks av naiva kroniska HCV-patienter innan DAA-behandling påbörjas i relation till det efterföljande behandlingsresultatet och deras eventuella inverkan på misslyckandet med att kontrollera infektion är dock inte tillgänglig. De få tillgängliga resultaten på anti-HCV-immunsvar vid kronisk HCV-infektion har genererats hos patienter som behandlats med DAA-kurer som inte ingår i föreliggande riktlinjer utan utvärdering enligt resultatet. Syftet med den föreliggande studien kommer således att vara att förstå huruvida uteblivet svar på terapi är associerat med en bredare och djupare antiviral immundysfunktion, genom att jämföra individuella HCV-specifika T-cellssvar i två grupper av patienter som svarar och som inte svarar. Antagandet som görs är att möjliga defekter av T-cellssvar som är förknippade med misslyckandet med att svara på DAA-terapi inte bör modifieras väsentligt av en ineffektiv behandling som gör det möjligt att karakterisera den immunologiska bakgrunden hos patienter som inte svarar efter slutet av en ineffektiv behandlingscykel och att jämför resultat med förbehandlingssvar vid baslinje från naiva, viremiska patienter som därefter tar bort viruset. En förbehandlingsanalys även för patienter som inte svarar skulle kräva att ett stort antal naiva patienter registreras för att identifiera ett tillräckligt antal patienter som inte svarar, vilket gör studien omöjlig och extremt lång. Med denna strategi kommer rekryteringen istället att vara mycket snabb eftersom de flesta patienter som registrerats vid baslinjen förväntas svara, medan patienter som inte svarar kommer att studeras efter avslutad terapi och efter en adekvat uttvättningsperiod på 6 till 12 månader och före påbörjad återbehandling har redan identifierats i de samarbetande centran och kommer att vara lätt tillgängliga för studien så snart protokollet har godkänts. Baserat på resultaten kan möjliga mål för framtida analyser vara att ytterligare på molekylär nivå karakterisera T-cellsfunktionella defekter hos patienter som inte svarar för att definiera om och med vilka strategier deras korrigering kan representera ett genomförbart tillvägagångssätt för att inducera/återställa en effektiv anti -viralt svar för att komplettera och stärka effekten av senaste generationens DAA. Slutligen kan karakterisering av skyddande immunitet hos patienter som inte svarar göra det möjligt att identifiera baslinjeprediktorer för icke-svar på terapi som ska användas i den dagliga kliniska praktiken.

Studiebakgrund Frekvensen av ihållande viral respons (SVR) hos naiva icke-cirrotiska patienter som behandlats med IFN-fria DAA är mellan 95 % och 100 %, men svarsfrekvensen är lägre i specifika undergrupper av patienter, inklusive genotyp 3 cirrotika och patienter med dekompenserad cirros, oavsett den infekterande genotypen. Den höga effekten av DAA-baserade terapier bekräftas i verkliga kohorter, som visar en SVR-frekvens endast något lägre än registreringsstudier. Även om frekvensen av misslyckande med DAA-terapi är ganska begränsad (cirka 5%), förväntas det totala antalet icke-svarande patienter vara högt på grund av det höga antalet kroniskt HCV-infekterade patienter som behöver behandling. Behandlingssvikt resulterar oftast i återfall och mer sällan i virusgenombrott under behandling. Olika faktorer tros vara inblandade i icke-svar på terapi, inklusive uppkomsten av resistensmutationer, suboptimal behandling på grund av felaktig genotypdefinition och avancerad leversjukdom.

Rollen av RAV vid utgångsläget för att fastställa behandlingsmisslyckande diskuteras fortfarande och resistenstestning vid utgångsläget verkar ha begränsad klinisk användbarhet. Istället är uppkomsten av RAV under DAA-baserade regimer och dess roll för att fastställa virologisk misslyckande väl dokumenterad. Även om läkemedelsresistenta varianter upptäcks hos en stor del av patienter som inte svarar, är deras roll för att försämra behandlingens effekt dock inte helt klar.

Användningen av för närvarande tillgängliga andra generationens kommersiella analyser för HCV-genotypning har minskat risken för genotypfelklassificering, men möjligheten för blandade infektioner med en procentandel av olika genotyper/subtyper under känsligheten för de metoder som tillämpas i den kliniska praktiken är fortfarande en ev. orsak till utebliven behandling på grund av suboptimal behandling.

Uppkomsten av resistenta stammar och suboptimal behandling på grund av felaktig genotypdetektering kan dock bara förklara en del av fall av behandlingsmisslyckande och värdrelaterade faktorer kan spela en roll, särskilt det antivirala immunsvaret. Faktum är att medfödda och adaptiva immunsvar är kända för att vara djupt försämrade vid kronisk HCV-infektion men mycket begränsad information finns tillgänglig om det möjliga bidrag som bakgrundsimmunsvar kan ge till det slutliga resultatet av DAA-behandling. I motsats till PegIFN-baserade terapier indikerar nyligen genomförda studier på DAA-behandlade patienter att frekvensen och funktionen av HCV-specifika CD8-celler kan öka under IFN-fria terapier med partiell vändning av deras utmattade fenotyp. Dessutom kan DAA-terapi modulera NK-cellsutrymmet och korrigera den NK-cellaktiverade fenotypen som är typisk för kroniska HCV-patienter. Sålunda kan nivån av försämring av antiviral immunitet vid baslinjen påverka den efterföljande sannolikheten för immunåterställning vid terapi med större chanser för resistens mot DAA-behandling när immunhämningen vid baslinjen är djupare och bredare. Denna hypotes måste testas.

Primära slutpunkter Syftet med studien kommer att vara att jämföra intensitet (totala nivåer av antivirala funktioner) och kvalitet (multispecificitet och multifunktionalitet) hos det övergripande HCV-specifika T-cellsvaret hos patienter som inte svarar (med och utan detekterbar) resistensassocierade varianter - RAV) och svar på DAA-terapi. För att uppnå detta mål kommer CD4- och CD8-medierade svar att bedömas genom att använda överlappande syntetiska peptider som täcker det övergripande HCV-proteomet av genotyp 1 för att karakterisera T-cellsreaktivitet mot alla HCV-proteiner, i termer av cytokinproduktion (IL2, IFN- g och TNF-a) och cytotoxisk potential (CD107-degranulering).

• Som ett primärt effektmått kommer den övergripande intensiteten av T-cellssvar att bedömas hos patienter som svarar och som inte svarar; den totala intensiteten av individuell T-cellsreaktivitet kommer att definieras genom att summera de olika analyserade T-cellsparametrarna (cytokinproduktion och cytotoxicitet, som detekterats i totala CD3-celler och CD4/CD8-undergrupper) för varje enskild responder och non-responder patient; de resulterande värdena kommer sedan att jämföras i de två grupperna av patienter.
• På en andra nivå av analys kommer kvalitativa skillnader i T-cellsreaktivitet mellan responder- och icke-responderpatienter att bedömas i termer av multifunktionalitet och multispecificitet av HCV-specifika T-cellsvar, genom att jämföra uttrycket av varje enskild funktion separat. (IL2, IFN-g, TNF-a) och kapaciteten hos varje enskilt HCV-protein att inducera T-cellssvar i de två grupperna av patienter.

Karakterisering av HCV-specifika T-cellssvar.

1. För att analysera global CD4+- och CD8+-reaktivitet mot strukturella och icke-strukturella HCV-proteiner kommer en omfattande panel av överlappande 15-mer-peptider som täcker hela HCV-sekvensen (genotyp 1) att användas; T-cellssvar kommer att analyseras genom flödescytometrisk intracellulär cytokinfärgning (ICS) för IFN-g, IL-2 och TNF-a och för degranulering (uppreglering av CD107) in vitro (efter 10 dagars peptidstimulering) och genom Elispot för IFN-g ex-vivo (efter kortvarig peptidstimulering); syntetiska peptidepitoper med HLA klass I- och klass II-begränsade specificiteter och kända för att vara målen för CD8+- och CD4+-svar mot olika HCV-icke-relaterade virus och patogener (CMV, EBV, FLU) kommer att användas som kontroller.
2. För att ytterligare analysera CD8+ T-cellsreaktivitet kommer HLA-A2/peptiddextramerer innehållande några av de mest välkända HLA-A2-begränsade epitoperna av HCV att användas i HLA-A2+-patienter för att kvantifiera cirkulerande virusspecifika CD8+-celler och för att mäta expansionskapacitet med jämföra dextramer-positiva CD8+-cellfrekvenser ex vivo och efter 10 dagars peptidstimulering.
3. Hos icke-responderande patienter som visar uppkomsten av resistensmutationer, kommer specifika peptider som motsvarar variantsekvenserna att syntetiseras och användas för att analysera om framväxande mutationer kan påverka HCV-specifik T-cellsaktivering och funktion. För detta ändamål kommer den stimulerande effekten på olika T-cellsfunktioner av prototyp- och variantpeptider (cytokinproduktion, cytotoxicitet, expansionskapacitet) att jämföras

Sekundära slutpunkter

1. Analys av ytterligare immunpopulationer och serumfaktorer som är kända för att vara relevanta med avseende på kontroll av virusinfektion och modulering av T-cellssvar.

   • Natural Killer (NK) cellanalys: NK-cells fenotyp kommer att studeras genom att bedöma uttrycket av specifika markörer, såsom CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR genom flödescytometri; NK-cellsfunktion kommer att studeras genom att testa IFN-g/TNF-a-produktion och CD107-degranulering efter PBMC-inkubation över natten med lämpliga stimuli.
   • Analys av T-regulatoriska celler (Treg): frekvens, fenotyp och funktion kommer att studeras på hela PBMCs samfärgade med CD3, CD4, CD25, FoxP3 och CD45RA.
   • Serumkoncentrationen av cytokiner, kemokiner och ISG, inklusive IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g och IL28, kommer att analyseras i patienternas sera med Luminex-teknologin.
2. Identifiering av baslinjeprediktorer för uteblivet svar på DAA-terapi Belysande av effekten som det antivirala immunsvaret kan ha vid uteblivet svar på terapier med eller utan proteashämmare