Isännän immuniteetin rooli suoran antiviraalisen aineen (DAA) terapiassa ei-vasteessa

Tutkimuksen tavoite ja hypoteesi Projektin taustalla oleva hypoteesi on, että antiviraalisen immuunijärjestelmän toimintahäiriön taso kroonisessa HCV-infektiossa on syy-tekijä, joka voi vaikuttaa hoitovasteen puuttumiseen. Saatavilla ei kuitenkaan ole tietoa yksittäisten antiviraalisten T-soluvasteiden ominaisuuksista, joita naiiveja saaneet krooniset HCV-potilaat ilmaisivat ennen DAA-hoidon aloittamista suhteessa hoidon myöhempään tulokseen ja niiden mahdolliseen vaikutukseen infektion hallinnan epäonnistumiseen. Harvat saatavilla olevat tulokset anti-HCV-immuunivasteista kroonisessa HCV-infektiossa on tuotettu potilailla, joita on hoidettu DAA-hoito-ohjelmilla, jotka eivät sisälly näihin ohjeisiin ilman tulosten mukaista arviointia. Tämän tutkimuksen tavoitteena on siten ymmärtää, liittyykö hoitoon reagoimattomuus laajempaan ja syvempään antiviraaliseen immuunihäiriöön vertaamalla yksittäisiä HCV-spesifisiä T-soluvasteita kahdessa vasteen ja ei-vastepotilaiden ryhmässä. Oletuksena on, että T-soluvasteiden mahdollisia puutteita, jotka liittyvät siihen, että DAA-hoitoon ei saada vastetta, ei pitäisi olennaisesti muuttaa tehottomalla hoidolla, joka mahdollistaa vasteen saamattomien potilaiden immunologisen taustan karakterisoinnin tehottoman hoitojakson jälkeen ja vertailla tuloksia naimattomien vireemisten potilaiden lähtötason hoitovasteisiin, jotka myöhemmin poistavat viruksen. Hoitoa edeltävä analyysi myös potilaille, joilla ei ole vastetta, edellyttäisi valtavan määrän hoitoon saamattomia potilaita, jotta löydettäisiin riittävä määrä ei-vastaavia potilaita, mikä tekisi tutkimuksesta mahdotonta ja äärimmäisen pitkän. Tällä strategialla rekrytointi on sen sijaan erittäin nopeaa, koska useimpien lähtötilanteessa mukana olleiden potilaiden odotetaan reagoivan, kun taas potilaiden, jotka eivät saa vastetta, joita tutkitaan hoidon päätyttyä ja riittävän 6–12 kuukauden pesujakson jälkeen ja ennen aloitettava uusintahoito on jo tunnistettu yhteistyökeskuksissa, ja ne ovat helposti saatavilla tutkimukseen heti, kun protokolla on hyväksytty. Tulosten perusteella tulevien analyysien mahdollinen tavoite voisi olla karakterisoida edelleen molekyylitasolla ei-vastepotilaiden T-solujen toiminnallisia puutteita, jotta voidaan määritellä, voiko niiden korjaaminen olla toteuttamiskelpoinen lähestymistapa tehokkaan anti-indusoimiseksi/palauttamiseksi, ja millä strategioilla. -virusvaste täydentää ja vahvistaa viimeisen sukupolven DAA:n vaikutusta. Lopuksi, suojaavan immuniteetin karakterisointi potilailla, jotka eivät reagoi vasteeseen, voisivat mahdollistaa päivittäisessä kliinisessä käytännössä käytettävän hoitovasteen puuttumisen perustason ennustajien tunnistamisen.

Tutkimuksen tausta Pitkäkestoisen virusvasteen (SVR) määrä naiiveilla ei-kirroosipotilailla, joita hoidetaan IFN-vapaalla DAA:lla, on 95–100 %, mutta vasteprosentti on alhaisempi tietyissä potilasalaryhmissä, mukaan lukien genotyypin 3 kirroosipotilaat ja potilaat, joilla on dekompensoitunut kirroosi, infektoivasta genotyypistä riippumatta. DAA-pohjaisten hoitojen korkea tehokkuus on vahvistettu todellisissa kohorteissa, joiden SVR-aste on vain hieman pienempi kuin rekisteröintitutkimuksissa. Vaikka DAA-hoidon epäonnistumisaste on melko vähäinen (noin 5 %), hoitoon reagoimattomien potilaiden kokonaismäärän odotetaan olevan korkea, koska hoitoa tarvitsevien kroonisesti HCV-infektoituneiden potilaiden lukumäärä on suuri. Hoidon epäonnistuminen johtaa useimmiten uusiutumiseen ja harvemmin hoidon aikana tapahtuvaan viruksen läpimurtoon. Eri tekijöiden uskotaan vaikuttavan hoitovasteen puuttumiseen, mukaan lukien resistenssimutaatioiden ilmaantuminen, väärästä genotyypin määrittelystä johtuva suboptimaalinen hoito ja pitkälle edennyt maksasairaus.

Lähtötason RAV-arvojen roolista hoidon epäonnistumisen määrittämisessä keskustellaan edelleen, ja lähtötason resistenssitestillä näyttää olevan rajallinen kliininen käyttökelpoisuus. Sen sijaan RAV:ien ilmaantuminen DAA-pohjaisten hoito-ohjelmien aikana ja sen rooli virologisen epäonnistumisen määrittämisessä on hyvin dokumentoitu. Vaikka lääkeresistenttejä variantteja havaitaan suurella osalla potilaista, jotka eivät saa vastetta, niiden rooli hoidon tehokkuuden heikkenemisessä ei kuitenkaan ole täysin selvä.

Tällä hetkellä saatavilla olevien toisen sukupolven kaupallisten määritysten käyttö HCV-genotyyppien määrittämiseen on vähentänyt genotyypin virheellisen luokittelun riskiä, ​​mutta sekainfektioiden mahdollisuus, jossa eri genotyyppien/alatyyppien prosenttiosuus on alle kliinisessä käytännössä käytettyjen menetelmien herkkyyden, on edelleen mahdollinen. hoitovasteen puuttumisen syynä suboptimaalisen hoidon vuoksi.

Resistenttien kantojen ilmaantuminen ja epäoptimaalinen hoito virheellisen genotyypin havaitsemisen vuoksi voivat kuitenkin selittää vain osan hoidon epäonnistumistapauksista, ja isäntään liittyvillä tekijöillä voi olla merkitystä, erityisesti virustenvastaisella immuunivasteella. Itse asiassa synnynnäisten ja adaptiivisten immuunivasteiden tiedetään olevan syvästi heikentyneet kroonisessa HCV-infektiossa, mutta saatavilla on vain vähän tietoa mahdollisesta vaikutuksesta, jonka tausta-immuunivasteet voivat antaa DAA-hoidon lopputulokseen. Toisin kuin PegIFN-pohjaisissa hoidoissa, viimeaikaiset tutkimukset DAA-hoidetuilla potilailla osoittavat, että HCV-spesifisten CD8-solujen esiintymistiheys ja toiminta voivat lisääntyä IFN-vapaissa hoidoissa, kun niiden uupunut fenotyyppi muuttuu osittain. Lisäksi DAA-hoito voi moduloida NK-soluosastoa korjaaen NK-soluaktivoitua fenotyyppiä, joka on tyypillistä kroonisille HCV-potilaille. Siten antiviraalisen immuniteetin perustason heikkenemisen taso saattaa vaikuttaa myöhempään immuunijärjestelmän palautumisen todennäköisyyteen hoidon aikana, jolloin on enemmän mahdollisuuksia vastustuskykyyn DAA-hoidolle, kun lähtötason immuuni-inhibitio on syvempää ja laajempaa. Tämä hypoteesi on testattava.

Ensisijaiset päätepisteet Tutkimuksen tavoitteena on verrata HCV-spesifisen T-soluvasteen yleisen intensiteettiä (viruksenvastaisten toimintojen kokonaistasot) ja laatua (monispesifisyys ja monitoiminnallisuus) potilailla, jotka eivät reagoi vasteeseen (jolla on havaittavissa oleva tai ei). resistenssiin liittyvät variantit - RAV:t) ja DAA-hoitoon reagoiva. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi CD4- ja CD8-välitteisiä vasteita arvioidaan käyttämällä päällekkäisiä synteettisiä peptidejä, jotka kattavat genotyypin 1 koko HCV-proteomin T-solujen reaktiivisuuden karakterisoimiseksi kaikille HCV-proteiineille sytokiinituotannon (IL2, IFN-) suhteen. g ja TNF-a) ja sytotoksinen potentiaali (CD107 degranulaatio).

• Ensisijaisena päätetapahtumana arvioidaan T-soluvasteiden kokonaisintensiteetti potilailla, jotka reagoivat ja ei reagoi; yksittäisten T-solujen reaktiivisuuden kokonaisintensiteetti määritetään laskemalla yhteen eri analysoidut T-soluparametrit (sytokiinituotanto ja sytotoksisuus, joka on havaittu CD3-solujen kokonaismäärästä ja CD4/CD8-alaryhmistä) kullekin yksittäiselle vasteelle ja ei-vastepotilaalle; saatuja arvoja verrataan sitten kahdessa potilasryhmässä.
• Analyysin toisella tasolla laadullisia eroja T-solureaktiivisuudessa reagoivien ja ei-responsoivien potilaiden välillä arvioidaan HCV-spesifisten T-soluvasteiden monitoiminnallisuuden ja monispesifisyyden kannalta vertaamalla kunkin yksittäisen toiminnon ilmentymistä erikseen. (IL2, IFN-g, TNF-a) ja kunkin yksittäisen HCV-proteiinin kyky indusoida T-soluvasteita kahdessa potilasryhmässä.

HCV-spesifisten T-soluvasteiden karakterisointi.

1. Globaalin CD4+- ja CD8+-reaktiivisuuden analysoimiseksi rakenteellisia ja ei-rakenteellisia HCV-proteiineja vastaan ​​käytetään kattavaa päällekkäisten 15-meeripeptidien paneelia, joka kattaa koko HCV:n (genotyypit 1) sekvenssin; T-soluvasteet analysoidaan virtaussytometrisellä solunsisäisellä sytokiinivärjäyksellä (ICS) IFN-g:n, IL-2:n ja TNF-a:n varalta ja degranulaatiosta (CD107:n lisääntyminen) in vitro (10 päivän peptidistimulaation jälkeen) ja Elispot IFN-g:lle ex vivo (lyhytaikaisen peptidistimulaation jälkeen); kontrolleina käytetään synteettisiä peptidiepitooppeja, joilla on HLA-luokan I ja luokan II rajoitetut spesifisyydet ja joiden tiedetään olevan CD8+- ja CD4+-vasteiden kohteita eri HCV:hen liittymättömiä viruksia ja patogeenejä (CMV, EBV, FLU) vastaan.
2. CD8+ T-solureaktiivisuuden analysoimiseksi edelleen HLA-A2/peptididekstrameerejä, jotka sisältävät joitain HCV:n tunnetuimpia HLA-A2-rajoittuneita epitooppeja, käytetään HLA-A2+-potilailla kiertävien virusspesifisten CD8+-solujen kvantifiointiin ja laajenemiskapasiteetin mittaamiseen vertaamalla dekstrameeripositiivisten CD8+-solujen frekvenssiä ex vivo ja 10 päivän peptidistimulaation jälkeen.
3. Ei-responsiivisilla potilailla, joilla on resistenssimutaatioiden ilmaantumista, syntetisoidaan spesifisiä peptidejä, jotka vastaavat muunnossekvenssejä, ja niitä käytetään analysoimaan, voivatko esiintulevat mutaatiot vaikuttaa HCV-spesifiseen T-solujen aktivaatioon ja toimintaan. Tätä tarkoitusta varten verrataan prototyyppi- ja varianttipeptidien stimuloivaa vaikutusta erilaisiin T-solutoimintoihin (sytokiinituotanto, sytotoksisuus, laajentumiskyky)

Toissijaiset päätepisteet

1. Muiden immuunipopulaatioiden ja seerumitekijöiden analyysi, joiden tiedetään olevan merkityksellisiä virusinfektion hallinnassa ja T-soluvasteiden moduloinnissa.

   • Natural Killer (NK) -soluanalyysi: NK-solufenotyyppiä tutkitaan arvioimalla spesifisten markkerien, kuten CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR, ilmentyminen virtaussytometrisesti; NK-solujen toimintaa tutkitaan testaamalla IFN-g/TNF-a:n tuotantoa ja CD107-degranulaatiota yön yli tapahtuvan PBMC-inkuboinnin jälkeen sopivien ärsykkeiden kanssa.
   • T-säätelysolun (Treg) analyysi: esiintymistiheyttä, fenotyyppiä ja toimintaa tutkitaan kokonaisilla PBMC-soluilla, jotka on värjätty yhdessä CD3:lla, CD4:llä, CD25:llä, FoxP3:lla ja CD45RA:lla.
   • Sytokiinien, kemokiinien ja ISG:n, mukaan lukien IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g ja IL28, pitoisuudet seerumissa analysoidaan potilaiden seerumeista Luminex-tekniikalla.
2. DAA-hoitoon reagoimattomuuden perustason ennustajien tunnistaminen Sen vaikutuksen selvittäminen, joka virusten vastaisella immuunivasteella voi olla vastetta puuttuessa hoitoihin proteaasi-inhibiittoreiden kanssa tai ilman niitä